c(RGDfC)-PEG-PCL靶向納米載體的合成及其條件優化

張 旭,葛 飛,朱龍寶,李婉珍,宋 平,陶玉貴

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

化學治療(化療)是臨床治療惡性腫瘤的主要方法之一[1]，但化療藥物的生物利用度低、選擇性差，藥物進入體內后，迅速分散到體內的各組織、器官中，只有少部分化療藥物能夠隨機到達腫瘤部位，導致化療藥物對腫瘤細胞和正常組織、器官都會造成殺傷[2-3]。如何使化療藥物精確遞送至腫瘤部位成為腫瘤治療的研究熱點。納米科學技術在材料合成、生物和藥學領域的廣泛應用，為靶向遞送化療藥物提供了機遇[4]。其中納米載體由于具有靶向遞送、可控釋放、較低的生物毒性和更高的藥物生物利用度等特點，已經成為化療藥物遞送的熱門研究領域[5-6]。

納米材料聚己內酯(PCL)以其優良的生物降解性及生物相容性，近年來被廣泛應用到藥物載體領域，并獲得美國FDA的批準[7]。聚己內酯由幾內酯開環聚合得到，具有很好的柔韌性和可加工性，其熔點為59～64℃，這為其應用于藥物可控釋放提供了依據。但表面具有疏水性的PCL在體內容易被蛋白質吸附和網狀內皮細胞識別并捕獲，這導致其在體內的循環時間減少[8]。為了滿足聚己內酯作為藥物載體的應用需求，通常在其表面進行親水性修飾。聚乙二醇(PEG)是一種生物相容性好、毒性低的水溶性聚合物[9]，PEG與PCL進行共聚，形成PEG-PCL共聚物，有效地提高了其在體內的循環時間。但PEG-PCL載體在體內無法主動靶向腫瘤細胞，僅僅依靠高通透性和滯留效應(EPR)無法在腫瘤部位大量積累，使得治療效果降低[10]。因此，對PEG-PCL表面進行靶向性修飾非常必要。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列且廣泛存在于體內的短肽，它可以與腫瘤部位特異性表達的αvβ3、αvβ5等整合素特異性結合，從而達到主動靶向腫瘤部位的目的[11]。

研究合成了具有主動靶向性的納米載體c(RGDfC)-PEG-PCL，并優化了c(RGDfC)-PEG-PCL的合成條件，探索了c(RGDfC)-PEG-PCL的最佳合成條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-1-叔丁酯(Fmoc-Asp-otbu)、N-芴甲氧羰酰基-2,2,4,6,7-1五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸(Fmoc-Arg(pbf)-OH)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(Fmoc-Cys(trt)-OH)、N-芴甲氧羰基-D-苯丙氨酸(Fmoc-D-Phe-OH)、N-芴甲氧羰基-L-甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)以及2-氯樹酯(負載量0.98 mmol·g-1，購于合肥國肽生物科技有限公司)；N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、 (3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸鹽(PyAOP)、N-乙基二異丙胺(DIEA)、二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)以及三氟乙酸(TFA)、茚三酮等試劑均為分析純，甲醇、乙腈為色譜純(購于阿拉丁試劑上海有限公司)；馬來酰亞氨基-聚乙二醇-聚己內酯(Mal-PEG113- PCL55，購于上海芃碩生物科技有限公司)。

Bruker AVANCE Ⅲ 600M型核磁共振譜儀(以TMS為內標，2% D2O與98% H2O為溶劑，德國Bruker公司)；LC-20A 高效液相色譜儀、Shim-pack VP-ODS C18液相色譜柱、ESI-MS-8030三重四極桿質譜儀(日本島津公司);RE-52型旋轉蒸發儀(上海青浦滬西儀器廠)；DFY-5/25 低溫恒溫反應浴儀(常州諾基儀器有限公司)；2XZ型旋片式真空泵(上海雙鵝制冷設備有限公司)、SHB-IV循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.2 c(RGDfC)-PEG-PCL的合成

(1)利用固相合成法合成直鏈肽RGDfC。在砂芯反應器中合成得到含有直鏈五肽RGDfC的樹脂，用全保護切割法將多肽與樹酯分離，冷凍干燥后得到粗品直鏈肽RGDfC，粗品用半制備型高效液相色譜進行純化，得到高純度的直鏈肽RGDfC。

(2)用液相環合法合成環肽c(RGDfC)。取純化后的直鏈肽RGDfC溶于無水二氯甲烷中，加入PyAOP、HOAT和DIEA作為縮合劑，0 ℃下過夜反應；得到的環肽用TFA切割法除去氨基酸側鏈的保護基，得到粗品環肽c(RGDfC)；粗品環肽c(RGDfC)用高效液相色譜進行純化得到高純度的環肽。

(3)c(RGDfC)-PEG-PCL的合成。稱取50.0 mg靶向環肽c(RGDfC)和10.0 mg馬來酰亞氨基-聚乙二醇-聚己內酯(Mal- PEG113-PCL55)于干凈的燒杯中，加入10 mL的DMF，并用玻璃棒攪拌直至固體完全溶解，調節pH值在7.5～8.0之間，加入DIEA作為催化劑，攪拌反應24 h。

1.3 c(RGDfC)-PEG-PCL靶向納米載體的表征

(1)質譜分析。利用ESI-MS對合成的靶向環肽進行分析。取少量c(RGDfC)樣品，以甲醇為溶劑進行稀釋溶解，甲醇為測試所用的流動相，測試模式為正離子模式。

(2)核磁表征。利用核磁共振譜儀(以TMS為內標，2% D2O與98% H2O為溶劑)對c(RGDfC)-PEG-PCL進行核磁表征，并對特征峰進行歸屬。

(3)c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率分析。反應過程中游離的靶向環肽含量會隨著反應的進行而減少，所以可以通過測定反應前后靶向環肽的量，從而計算出產物的合成率。采用高效液相色譜儀對反應前后的溶液進行分析，根據c(RGDfC)在高效液相色譜中的出峰面積來計算合成率，計算公式如下：

式中，S0為c(RGDfC)的初始峰面積；S為反應后c(RGDfC)的峰面積。

1.4 c(RGDfC)-PEG-PCL靶向納米載體的合成優化

靶向環肽c(RGDfC)與納米載體Mal-PEG-PCL合成的本質是邁克爾加成反應，根據其反應特點，從反應時間、pH值、溫度、催化劑以及溶劑這5個方面研究c(RGDfC)-PEG-PCL合成的最佳反應條件。

(1)反應時間對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響。固定pH值為7.5、溫度為25 ℃，用DIEA作為催化劑、DMF作為溶劑，考察反應時間對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響，反應時間設定為4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h和28 h。

(2)pH值對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響。固定反應時間為24 h、溫度為25 ℃，用DIEA作為催化劑、DMF作為溶劑，考察pH值對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響，pH值設定為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0。

(3)溫度對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響。固定反應時間為24 h、pH值為7.5，用DIEA作為催化劑、DMF作為溶劑，考察溫度對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響，溫度設定為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃。

(4)催化劑對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響。固定反應時間為24 h、pH值為7.5、溫度為25 ℃，用DMF作溶劑，考察加入催化劑對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響，設定為無催化劑組和加入催化劑DIEA組。

(5)溶劑對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響。固定反應時間為24 h、pH值為7.5、溫度為25 ℃，用DIEA作為催化劑，考察溶劑對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響，溶劑設定為甲醇、二甲基亞砜、DMF和DCM。

2 結果與討論

2.1 質譜分析

靶向環肽c(RGDfC)的質譜圖(ESI-MS)如圖1所示。c(RGDfC)的理論分子量為578.25，質譜中主要的電荷峰只有一個，其電荷為579.25(M+H)H+，與理論分子量一致，說明合成的多肽確為目標產物c(RGDfC)。

圖1 c(RGDfC)的ESI-MS譜圖

2.2 核磁表征

靶向納米載體c(RGDfC)-PEG-PCL的氫譜圖(1H-NMR)如圖2所示。對氫譜圖中的各個峰進行歸屬，可以看出圖譜中出現了環肽的特征峰，即酰胺健上的氫和苯環上的氫，這是PEG-PCL載體上沒有的峰，證明靶向環肽和載體已經成功地連接上了。

圖2 c(RGDfC)-PEG-PCL的1H-NMR譜圖

2.3 反應時間對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

時間對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響如圖3所示。由圖3可知，在0～12 h內，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率快速上升，在此階段反應迅速，產物迅速積累；在12～24 h內，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率緩慢上升，在此階段反應逐漸減慢，產物積累緩慢；在24～28 h內，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率幾乎不變，在此階段反應停止，產物不再積累。這可能是因為隨著反應的進行，反應物的濃度降低，產物積累變慢。所以，選擇反應時間為24 h，c(RGDfC)和Mal-PEG-PCL的反應結束。

2.4 pH值對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

pH值對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響如圖4所示。由圖4可知，pH在7.5～8.0之間，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率達到最高；pH高于8.0時，隨著pH的增大，c(RGDfC)- PEG-PCL的合成率降低。這是由于堿性條件有利于加成反應的進行，但堿性過高會導致副產物的生成，因此最佳pH在7.5～8.0之間。

圖3 時間對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響 圖4 pH值對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

2.5 溫度對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

溫度對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響如圖5所示。由圖5可知，在溫度為25 ℃時，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率達到最高；當溫度高于25 ℃時，隨著溫度的升高，c(RGDfC)- PEG-PCL的合成率降低，這是由于提高溫度會增強邁克爾加成反應的逆反應，不利于合成產物c(RGDfC)-PEG-PCL的積累，所以，選擇在25 ℃左右為最佳反應溫度。

2.6 催化劑對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

催化劑對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響如圖6所示。由圖6可知，在反應中加入堿性催化劑DIEA可以提高c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率。由于堿性催化劑有利于反應物去質子形成陰離子，促進邁克爾加成反應的進行[12]，所以加入DIEA能夠促進c(RGDfC)-PEG-PCL的合成。

圖5 溫度對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響 圖6 催化劑對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

2.7 不同溶劑對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

不同溶劑對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響如圖7所示。由圖7可知，用DMF作為溶劑時，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率最高，這是由于多肽c(RGDfC)和Mal-PEG-PCL在DMF中能夠溶解完全，有利于反應的進行；用甲醇作溶劑時，由于有部分反應物無法溶解，導致c(RG DfC)-PEG-PCL的合成率降低；用DCM作溶劑時，c(RGDfC)-PEG-PCL的合成率最低，這可能是由于在反應過程中，DCM揮發導致反應物出現沉淀，進而導致c(RGDfC)-PEG -PCL的合成率降低；二甲基亞砜作為反應溶劑，c(RG DfC)-PEG-PCL的合成率與DMF相差不大。因此，選用DMF作為反應溶劑，c(RGDfC)- PEG-PCL的合成率最高。

圖7 不同溶劑對c(RGDfC)-PEG-PCL合成率的影響

3 結論

采用邁克爾加成法，在反應時間為24 h、pH值在7.5～8.0、溫度為25 ℃、加入堿性催化劑DIEA、用DMF作為反應溶劑的最佳反應條件下，將靶向環肽c(RGDfC)連接到載體Mal-PEG -PCL上，制備出具有腫瘤主動靶向性的納米載體——c(RGDfC)-PEG-PCL。控制反應時間為24 h，保證了反應完全的同時，提高了實驗效率；調節pH在7.5～8.0，堿性環境下有利于邁克爾加成反應的進行；控制溫度為25 ℃，有利于減少逆反應的發生，保持多肽的活性，提高合成率；加入堿性催化劑有利于巰基失去質子，形成陰離子，促進反應的進行；用DMF作溶劑，在保證原材料完全溶解的同時，有利于產物的回收。該靶向納米載體制備工藝簡單、生物相容性優良、靶向效果顯著，為腫瘤的精準治療提供了新的思路。