弓形蟲ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白對小鼠子宮基質細胞蛻膜化的影響

金 郁，計永勝，姚 湧，汪學龍

胚胎植入是一個復雜的過程，涉及到子宮與胚胎之間精確的相互作用。當胚胎附著在子宮內膜上后，在植入部位的基質細胞開始發生蛻膜化[1]。子宮蛻膜化對胚胎的植入和妊娠的維持至關重要。如果產婦子宮不經過蛻膜化，胚胎就不會正常發育。小鼠子宮蛻膜細胞在胚胎植入后以有序的凋亡和增殖來適應其快速生長發育的需要，現已證明，蛻膜細胞的增殖與退化是一個涉及多種因素的細胞凋亡過程[2-3]。在這個過程中，子宮內膜基質的增殖和凋亡需要嚴格遵循時空的發展。有研究[4]顯示，小鼠子宮基質細胞蛻膜化過程中的凋亡受到促進和抑制作用，都會導致蛻膜化的異常，導致著床位點的減少，引起著床的失敗。

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種屬于真球蟲目(Eucoccidiorid)、弓形蟲科(Toxoplasmatidae)、弓形蟲屬(Toxoplasma)的專性細胞內寄生原蟲，根據蟲體對小鼠毒力的差異可以將弓形蟲分為3型。弓形蟲ROP16蛋白同樣在不同蟲株間存在多態性。I型和III型蟲株(如RH、CTG)ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白可以通過直接和宿主細胞的STAT3結合，磷酸化STAT 705位的酪氨酸。目前有研究[5]表明其對宿主細胞的凋亡具有抑制作用。同時，ROP16Ⅰ/Ⅲ會誘導人神經母細胞瘤發生凋亡[6]。而ROP16Ⅰ/Ⅲ對于蛻膜細胞的影響鮮有報道。該實驗通過ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒感染原代小鼠蛻膜細胞，檢測凋亡相關指標，探討弓形蟲ROP16蛋白對妊娠小鼠子宮基質細胞蛻膜化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與實驗動物

1.1.1主要試劑 DMEM/F12培養基購自美國HYCLONE公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE試劑盒、RIPA裂解液、一抗稀釋液、ECL Kit化學發光試劑盒均購自南京碧云天生物技術公司；膠原酶Ⅱ、NC膜均購自美國Sigma公司；Western blot所用一抗anti-Bax、anti-Bcl-2、anti-Caspase3均購自美國Cell Signaling公司；二抗HRP羊抗兔、免疫熒光一抗anti-Vimentin、二抗羊抗兔均購自武漢博士德公司；流式細胞術凋亡試劑盒購自美國BD公司；E2、P4、cAMP試劑購自美國阿拉丁公司。

1.1.2實驗動物 6～8周齡清潔級昆明小鼠均為性成熟雌、雄鼠，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。小鼠的飼養以安徽醫科大學實驗動物使用指南為標準，符合動物倫理相關準則。雌、雄鼠按2 ∶1合籠，次晨發現陰栓者記為孕D0。

1.2 小鼠子宮基質細胞的原代培養取孕D4的雌鼠的子宮，剪凈系膜和多余脂肪，放入培養皿，用PBS沖洗2次后，將子宮剪碎，過程中可適當加入少量胰酶繼續剪，最終以約1只0.7 ml的體積加入胰酶。將加好酶液的培養皿在4 ℃放置1 h，再室溫1 h，然后用含10% FBS的培養液終止消化，轉入15 ml離心管，500 r/min離心5 min。然后用PBS洗滌沉淀1次，500 r/min離心5 min，棄上清液，然后加入配好的0.5%膠原酶Ⅳ，混勻，放入恒溫搖床，37 ℃消化30 min。然后終止消化，將組織液依次通過200目和400目的滅菌過濾網，收集濾液到50 ml的離心管，1 500 r/min離心5 min后用PBS洗滌沉淀，后1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加入含FBS的DMEM/F12培養基，重懸沉淀，計數后以1×105個/ml接種于6孔板。將細胞在培養箱培養2 h，等基質細胞貼壁后換液去除雜細胞。

1.3 小鼠子宮基質細胞純度鑒定將上述步驟取得的原代子宮基質細胞做細胞爬片，PBS洗3次，每次5 min，用4%多聚甲醛固定30 min后用PBS洗3次，用5%BSA封閉，37 ℃ 1 h，接著加入Vimentin抗體(1 ∶100)4 ℃孵育過夜，PBS洗3次。然后加熒光二抗(FITC標記二抗，1 ∶50)，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次。最后加入DAPI染核(1 ∶25)，室溫15 min，PBS洗3次，加入熒光猝滅劑后封片。在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光信號。

1.4 ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒感染小鼠子宮基質細胞并體外誘導蛻膜化培養小鼠原代子宮基質細胞24 h后，用ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒進行細胞感染，實驗分為空白對照組、空載慢病毒組和ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒轉染組。慢病毒轉染24 h后在培養基中加入1 μmol/L孕激素(P4)、10 nmol/L雌二醇(E2)、0.5 mmol/L環磷酸腺苷(cAMP)進行蛻膜化誘導，鏡下觀察細胞形態變化。并接著培養48 h，分別收集0、24、48 h的蛻膜細胞，提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR熒光染料法，以β-actin為內參，以比較Ct值法進行相對定量,觀察催乳素(prolactin,PRL) mRNA表達水平。PRL基因上游引物為5′-CTCCTCCTGTTGCTGA-3′，下游引物為5′-CAGTCGG GTCTTTCCC-3′，擴增長度為362 bp。內參基因β-actin上游引物為5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，下游引物為5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′， 擴增長度為228 bp。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡小鼠子宮基質細胞在轉染ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒并體外誘導蛻膜化72 h后，收集各組細胞，用胰酶消化下來后，用PBS和緩沖液依次洗滌后按凋亡試劑盒說明書染色，用流式細胞儀檢測各組凋亡率。

1.6 Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達水平收集細胞總蛋白，用SDS-PAGE電泳分離蛋白(20 μg/孔)，轉至PVDF膜，按順序孵育抗體(一抗濃度均為1 ∶1 000，二抗濃度為1 ∶5 000)，顯色。

2 結果

2.1 細胞純度鑒定采用免疫熒光方法檢測小鼠子宮基質細胞波形蛋白的表達，鑒定其純度，熒光顯微鏡下觀察，Vimentin蛋白主要集中于胞質，產生綠色熒光，用DAPI染核，產生藍紫色熒光。顯微鏡視野下隨機選取5個不同區域，計數波形蛋白陽性細胞數與細胞總數之比，結果顯示，提取的原代基質細胞純度為(95±2.5)%。見圖1。

2.2 成功誘導細胞蛻膜化在培養基中加入E2、P4和cAMP培養原代基質細胞，小鼠子宮基質細胞人工誘導蛻膜化后，分別在0、24、48 h測定PRL mRNA表達水平，結果顯示，隨著體外誘導蛻膜化時間的延長，PRL mRNA的表達會逐漸增加(P<0.05)，說明體外誘導蛻膜化成功。見圖2。

圖1 小鼠子宮內膜基質細胞的鑒定 ×200

A：熒光顯微鏡下觀察間質細胞標志物Vimentin蛋白；B：熒光顯微鏡下觀察DAPI染色的細胞核；C：合并觀察計數波形蛋白陽性細胞數與細胞總數

圖2 小鼠子宮基質細胞體外誘導蛻膜化 ×200

A：明場下觀察小鼠子宮基質細胞；B：經過體外誘導蛻膜化后，明場下觀察蛻膜細胞；C：小鼠子宮基質細胞體外誘導蛻膜化qRT-PCR測定PRL mRNA表達；與24 h比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 ROP16Ⅰ/Ⅲ重組慢病毒感染小鼠子宮基質細胞 ×200

A：明場下轉染ROP16Ⅰ/Ⅲ過表達重組慢病毒的蛻膜基質細胞；B：熒光顯微鏡下轉染ROP16Ⅰ/Ⅲ過表達重組慢病毒的蛻膜基質細胞；C：明場下轉染空載病毒的蛻膜基質細胞；D：熒光顯微鏡下空載病毒轉染的蛻膜基質細胞；E：明場下的蛻膜基質細胞；F：熒光顯微鏡下的蛻膜基質細胞

2.3 慢病毒成功轉染蛻膜細胞培養的原代小鼠子宮基質細胞分別感染ROP16Ⅰ/Ⅲ基因過表達和空載LV慢病毒并體外誘導蛻膜化培養72 h后，顯微鏡下觀察轉染情況。見圖3。

2.4 ROP16Ⅰ/Ⅲ對蛻膜細胞凋亡的影響流式細胞術結果顯示：ROP16Ⅰ/Ⅲ過表達組的蛻膜細胞凋亡率相較于空載組(F=111.4,P<0.01)和對照組(F=49.1,P<0.01)降低。見圖4。

2.5 Bax、Bcl-2蛋白表達Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白的表達水平后顯示：各組細胞在培養72 h后，對照組和空載組的Bax、bcl-2蛋白表達沒有明顯差異，而ROP16Ⅰ/Ⅲ轉染組Bax表達較對照組和空載組降低，Bcl-2表達較對照組和空載組則呈升高趨勢,因此ROP16Ⅰ/Ⅲ轉染組Bax/Bcl-2的值小于對照組(F=75.22,P<0.05)和空載組(F=51.13，P<0.05)。見圖5。

3 討論

胚泡和子宮是結構成分不同的兩種組織，植入是胚胎與子宮建立生理聯系的過程，是胚泡和子宮相互識別、黏附、容納的過程，所以植入是妊娠過程中的一個關鍵環節，稱為“植入窗口期”。植入過程中，子宮內膜和胚泡的滋養層都會發生一系列復雜的變化：植入位點的子宮內膜基質細胞首先會發生劇烈的增殖和分化，這種變化會逐漸延伸到整個子宮內膜。這些變化統稱為子宮蛻膜化。

圖4 各組基質細胞感染不同ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒的凋亡率

A：ROP16Ⅰ/Ⅲ慢病毒轉染組；B：陰性對照病毒組；C：對照組；D：各組凋亡率；與空載組比較：**P<0.01；與對照組比較：##P<0.01

圖5 Western blot法檢測Bax和Bcl-2表達與空載組比較：*P<0.05；與對照組比較：#P<0.05

子宮內膜進行蛻膜化的過程中，首先與子宮內膜基質細胞的正常增殖密切相關[7]。當胚泡附著在子宮內膜上皮時，在附著位置周圍的內膜上皮細胞會發生凋亡，而鄰近的基質細胞則會進行廣泛的增殖，增殖的基質細胞獲得多倍性而分化成特殊的細胞類型，此時基質細胞會向著床位點周圍擴展，逐步形成成熟的蛻膜細胞，然后隨著胚泡的植入，又會按照相同的趨勢持續退化和凋亡[8]，并被周圍的滋養層或巨噬細胞吞噬[9]。因為有了蛻膜化過程中細胞有序的增殖和退化，使胚泡周圍的蛻膜細胞的數量得以控制，所以控制了滋養細胞的侵襲。在此過程中，小鼠子宮內膜基質細胞經歷了形態學和分子水平的獨特變化[10]。蛻膜化過程中，著床位點的蛻膜細胞停止增殖，終末分化后形成的區域稱之為初級蛻膜區,第2次分化形成的區域稱之為次級蛻膜區，最后次級蛻膜區的細胞也會發生凋亡，使著床位點的腔隙增大以便容納生長的胚胎[11]。

在本實驗中，在孕鼠胚胎著床的時間段成功分離培養了子宮內膜基質細胞，在體外培養的小鼠子宮基質細胞中過表達ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白，并體外誘導蛻膜化時，結果顯示ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白上調了蛻膜細胞Bcl-2的表達并降低了Bax表達，抑制了蛻膜細胞的凋亡，提示可能導致初級蛻膜區的蛻膜細胞不能按照正常程序退化消失，同時段發育的胚胎不能獲得足夠相應的發展空間，同時，初級蛻膜區退化的受阻也會導致次級蛻膜區的發展受阻，也會導致接下來胚胎發展空間的受限，最終導致母胎界面的對話受到干擾，從而導致植入位點的數量減少，引起胚胎著床的不良結局。

ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白作為弓形蟲重要毒力因子，具有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸激酶活性，參與宿主細胞內信號轉錄活化因子(STATs)相關的磷酸化[12]。由于ROP16Ⅰ/Ⅲ能磷酸化STAT3，兩者作用后會從胞質中轉移至細胞核引起下游轉錄因子改變，結果就會干預宿主細胞內信號通路傳導[13-14]。磷酸化的STAT3進入細胞核內，直接與DNA結合，誘導抗凋亡蛋白(Bcl-xL、Mcl-1、survivin)的表達，所以STAT3通路的活化在多種細胞都有抗凋亡的作用[15]。 ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白可以通過磷酸化STAT3，介導細胞的凋亡變化。ROP16Ⅰ/Ⅲ蛋白在蛻膜細胞蛻膜化過程中抑制了細胞的凋亡，其中與細胞其他促凋亡因子之間的相互作用機制及信號通路和體內實驗對于不良妊娠的驗證是本研究下一步的研究方向和內容。