血清炎癥因子與SLE患者眼表狀態的相關性研究

王 安，顧正宇，廖榮豐，帥宗文

前期研究[1]已經證實不伴有繼發性干燥綜合征(secondary Sj?gren's syndrome, sSS)的系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)患者的干眼發病率及嚴重程度與SLE的活動度相關，然而具體機制尚不明確。為了進一步探索影響此類患者發生干眼的因素，該實驗擬研究血清細胞因子與此類患者干眼臨床體征的相關性。

基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)是一種基質金屬蛋白酶，它在炎癥、傷口的愈合和細胞凋亡的過程中發揮著重要作用。在干眼小鼠模型中，MMP-2參與到干眼的發生發展中[2]。白介素(interleukin，IL)-1，IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)屬于前炎癥因子，干眼人群淚液中的IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子的濃度較健康對照組升高[3]，并且這些細胞因子與干眼的臨床指標呈現密切相關性[4]。激肽釋放酶13(kallikrein 13， Klk13)是激肽系統的主要限速酶，對血壓、電解質及炎癥反應均有調節作用。關于Klk13對于干眼的影響尚無統一定論，該研究將Klk13作為一個候選細胞因子納入此項研究。

1 材料與方法

1.1 患者入選標準診斷符合SLE且不伴有其他的自身免疫性疾病，通過抗干燥綜合征A抗體 (S?gren's syndrome A antibody, anti-SSA antibody)和抗SSB抗體排除干燥綜合征患者，并且這些患者否認口干病史。患者過去1周無眼藥水使用史，無角膜接觸鏡佩戴史。患有白內障、玻璃體積血、視網膜脫離、翼狀胬肉、角膜新生物、瞼板腺功能障礙等疾病將從研究對象中去除。根據2017年淚膜眼表協會和干眼世界工作組II (tear film & ocular surface society and dry eye workshop II, TFOS DEWS II)干眼診斷共識，將納入研究的患者分為3組：眼表疾病指數(ocular surface disease index，OSDI)≥13且淚膜破裂時間(tear film break-up time，TBUT)<10 s定義為干眼組(n=11)，OSDI≥13或TBUT<10 s定義為干眼傾向組(n=25)，OSDI<13且TBUT≥10 s定義為對照組(n=18)。

1.2 干眼指標的測定淚河高度，第1次淚膜破裂時間和平均淚膜破裂時間通過眼表綜合分析儀keratograph 5M(德國Oculus公司)測定。患者的干眼癥狀通過國際公認的OSDI量表評估。

1.3 主要試劑MMP-2一抗、Klk13一抗、IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購自美國R&D systems公司； BCA蛋白濃度測定試劑盒購自海門市碧云天生物技術研究所；β-actin一抗、二抗購自北京中杉金橋公司。

1.4 主要儀器酶標儀購自美國BioTek公司；電泳、轉膜、凝膠成像系統購自美國Bio-Rad 公司。

1.5 實驗方法

1.5.1血液樣本的收集及準備 患者的外周靜脈血通過采血針收集到5 ml含有EDTA-K2抗凝劑的采血管中，將采血管放入高速離心機中以3 000 r/min離心5 min致使血清及血細胞上下分層，將上層血清分離到1.5 ml EP管中，勿吸到下層血細胞。將上述分離的血清放入-80 ℃冰箱凍存，以備進行下一步檢測。

1.5.2Western blot檢測MMP-2、Klk13在各組中的相對蛋白表達量 通過BCA法測量蛋白濃度，調整蛋白上樣量使每孔加入的蛋白總量相同。樣品用上樣緩沖液及巰基乙醇處理。10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，300 mA的電流恒流轉膜1.5 h。轉膜完成后，按照所需蛋白分子量大小將PVDF膜切割成相應大小，再將這些膜放入5%的脫脂奶粉中完成封閉。將含有目的蛋白的膜與相應1 ∶1 000抗體在4 ℃下孵育12 h，TBST漂洗3次，每次10 min，再將膜放入含有1 ∶5 000二抗的溶液中振搖2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，再向膜上加ECL顯色液在X光下膠片曝光。β-actin被用作內參。Image J用來測量圖片的灰度值，用目的蛋白/β-actin代表目的蛋白的相對表達水平。

1.5.3ELISA法測量IL-1、IL-6、TNF-α在各組中的濃度 嚴格按照R&D公司的ELISA試劑盒的操作步驟進行實驗。按照各濃度梯度稀釋標準品，取100 μl血清樣品加入各個抗體包被好的孔中室溫孵育2 h，蓋上封口膜以防污染，之后用洗板機洗板，再向各孔中加入200 μl酶標抗體，室溫孵育2 h，洗板機洗板，再向各孔中加入100 μl顯色液，孵育半小時后向各孔中加入50 μl終止液，加入終止液后半小時內在酶標儀下讀取450 nm的吸光度(optical density, OD)，與標準曲線對比，計算出各樣本的蛋白濃度。

1.6 統計學處理采用SPSS 19.0、GraphPad Prism 6.0、Matlab 2017b進行統計分析和作圖。所有的數據進行正態分布檢驗，對于符合正態分布的數據，用單因素方差分析比較3組之間的差異。對于不符合正態分布的數據，用Kruskal-Wallis test比較3組之間的差異。對于符合正態分布數據間的相關分析，用Pearson相關分析，對于不符合正態分布的數據間的相關分析，用Spearman相關分析。P<0.05(雙側)為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人群基線比較分析了年齡、病程、性別、相關抗體等指標在3組患者之間的差異，3組人群基本可比。在淚河高度(P<0.001)、第一次淚膜破裂時間(P<0.001)、平均淚膜破裂時間(P<0.001)、OSDI(P<0.001)這幾項指標中，3組人群之間的差異有統計學意義。見表1。

2.2 Western blot檢測各組MMP-2、Klk13的結果MMP-2在3組之間呈漸進性的改變，與對照組比較，干眼組患者血清中MMP-2的蛋白含量顯著升高，兩者之間的差異有統計學意義(P=0.016)。見圖1A、B。Western blot結果顯示，Klk13蛋白含量在3組之間的差異無統計學意義(P=0.621)。見圖1C。

2.3 ELISA法檢測3組患者中的IL-1、IL-6、TNF-α的含量比較3組患者血清中IL-1的濃度，差異有統計學意義(P<0.001)，IL-1在干眼傾向組(209.52±263.27) ng/L的表達量最高，而在干眼組(114.87±169.86 )ng/L中的表達量反而降低。比較3組患者IL-6的血清濃度，差異無統計學意義(P=0.268)。TNF-α在3組中呈梯度改變，干眼組(362.17±247.28 ) ng/L與對照組(122.65±125.38 ) ng/L之間的差異有統計學意義(P=0.014)。見圖2。

2.4 干眼指標和炎癥因子的相關分析MMP-2與OSDI之間(r=0.328,P=0.001)存在正相關，IL-1與淚河高度(r=-0.358,P<0.001)、第1次淚膜破裂時間(r=-0.424,P<0.001)、平均淚膜破裂時間(r=-0.472,P<0.001)之間均存在負相關，TNF-α與淚河高度(r=-0.211,P=0.037)、平均淚膜破裂時間(r=-0.278,P=0.006)、OSDI(r=0.238,P=0.018)之間均存在相關性。Klk13與所有的干眼指標均不存在相關性，IL-6與所有的干眼指標也不存在相關性。見表2、圖3。

3 討論

本研究通過臨床干眼相關檢查指標將不伴有sSS的SLE患者分為3組，分別探索各組患者外周血血清中細胞因子的含量及其與干眼指標的相關性。

研究結果顯示，MMP-2在干眼組、干眼傾向組和對照組中呈現逐漸降低的趨勢，并且MMP-2在干眼組和對照組中的差異有統計學意義，由此可認為MMP-2參與到干眼的發生中。研究表明活性氧/環加氧酶2/超氧化物歧化酶1/過氧化物酶4通路[5]、Toll樣受體通路[6]在角膜上皮細胞模型中參與到干眼的發生過程中，并與MMP-2的升高可能有關聯。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路可能與MMP形成惡性循環參與到干眼的形成過程中，抑制鞘氨醇-1-磷酸受體可能會打破MAPK和MMP形成的惡性循環，從而改善干眼狀況[7]。

研究[3]證實在干眼患者淚液中IL-1的表達量較對照組明顯增高，有研究[8]證實在干燥綜合癥小鼠模型的結膜和淚腺組織中，IL-1在蛋白水平和基因水平均較野生型對照組上調。本實驗的研究結果與之相符，證明IL-1參與到干眼的發病過程中。IL-1受體(IL-1R)在調節炎癥和免疫反應中起重要作用。IL-1與IL-1R結合后，募集IL-1R輔助蛋白(IL-1 receptor accessory protein, IL-1RAcP)以形成高親和力的IL-1R1/IL-1RAcP異二聚體受體，啟動下游炎癥級聯信號，例如核因子κB信號、MAPK信號等，這也許解釋了干眼傾向組與對照組之間的差別。然而干眼組與對照組之間無差別，可能原因是IL-1屬于早期炎癥因子，晚期抗炎癥因子細胞，如調節性T細胞活化釋放抗炎癥因子可拮抗炎癥因子的作用[9]。

表1 納入研究的SLE患者的基本資料

圖1 Western blot檢測3組患者血清中MMP-2、Klk13的相對表達量

圖2 ELISA檢測3組患者血清中IL-1、IL-6、TNF-α的濃度

圖3 TNF-α的濃度與平均淚膜破例時間、淚河高度、OSDI的相關性

表2 SLE患者血清中細胞因子與干眼臨床資料的相關性

TNF-α是由1型輔助性T細胞分泌的細胞因子，在抗原呈遞的過程中具有重要作用。研究[9-10]顯示，TNF-α在干眼動物模型的淚液、結膜、淚腺等組織的表達量較對照組明顯增高，這與本研究結果一致。此外，在干眼小鼠模型中，TNF-α阻斷劑能阻斷眼表的炎癥反應并改善眼表癥狀[11]。從相關性分析可看出，TNF-α更適合作為干眼癥患者的血清學標志物，因其與淚河高度、平均淚膜破裂時間、OSDI等干眼的相關指標均具有相關性。

本研究結果顯示IL-6在3組之間無差別，這與Jackson et al[12]研究結果相同，但與Lin et al[13]研究結果不同。研究[14]證實IL-6在人角膜上皮細胞模型中的表達量在干眼組較對照組增高。本研究結果與其他研究結果不同的一個可能原因是選取的研究對象為SLE患者，這些患者的整體炎癥因子的水平較高，可能在3組之中的差別不明顯。此外，樣本量較小也是一個可能原因。

有研究[15]顯示在干眼小鼠模型的血清中可檢測到Klk13，而在野生對照組小鼠血清中無Klk13的存在。然而，在本研究中，3組患者血清中的Klk13無明顯差異，這可能與樣本的物種差異有關。

綜上所述，本研究測定了不同眼表狀況的不伴有sSS的SLE患者血清中相關細胞因子，結果顯示MMP-2、IL-1、TNF-α這些細胞因子參與到干眼的發生過程中，并且TNF-α可能可以作為診斷干眼的一個血清學指標。本研究是首個探索MMP-2、Klk13、IL-1、IL-6、TNF-α在不伴有sSS的SLE患者血清中的含量與干眼臨床指標相關性的研究。MMP-2、IL-1、TNF-α影響干眼發生的具體機制及通路是下一步需要探討的問題。