MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3在胃低分化腺癌中的表達及意義

郭海州 安生花 林明哲 李進章 周毛 祁艷娟

(青海大學附屬醫院 1寧養院，青海 西寧 810001；2腫瘤內科；3腫瘤放療科)

胃腺癌好發于中老年人，以低分化腺癌較多見〔1〕。淋巴結和淋巴管播散是其轉移的主要方式，在病變形成時，間質可以觀察到小的新形成的淋巴管。間質淋巴管是伴隨著腫瘤的生長而形成的，與淋巴管促進因子有密切關系。血管內皮生長因子(VEGF)-D是新發現的淋巴管生成促進因子，通過VEGF受體(VEGFR)3起重要作用，促進D2-40陽性的淋巴管生成。腫瘤細胞侵襲性生長時可以浸潤脈管，并通過淋巴道形成播散〔2〕。基質金屬蛋白酶(MMP)家族不僅可以降解細胞外基質，破壞轉移的屏障，還可以促進脈管的生成。MMP-12是家族中的一員，最早是在巨噬細胞中提取的。近年來認為MMP-12可能有多種功能，包括促進腫瘤生長及調節脈管生成的作用等〔3〕。本文關注胃低分化腺癌患者術后組織中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3蛋白和mRNA的表達，探討其關系，分析其臨床意義。

1 材料和方法

1.1臨床資料 選擇2012年1月至2017年5月在青海大學附屬醫院確診為胃低分化腺癌，并行手術根治的患者共73例作為研究組1，均經術后病理確診，并符合世界衛生組織(WHO)中的診斷標準。本實驗由醫院倫理委員會批準。排除標準：①術前放、化療的患者；②有消化系統手術史的患者；③伴有其他器官腫瘤的患者。其中男38例，女35例，年齡36～85歲，平均61.3歲。選擇20例高-中分化胃腺癌術后組織作為對照組1，其中男10例，女10例，年齡37～80歲，平均58.6歲。選擇20例胃黏膜高級別上皮內瘤變組織作為對照組2，其中男10例，女10例，年齡32～78歲，平均54.3歲。選擇20例胃黏膜低級別上皮內瘤變組織作為對照組3，其中男10例，女10例，年齡34～76歲，平均54.1歲。選擇正常胃黏膜組織20例作為對照組4，其中男10例，女10例，年齡39～79歲，平均62.4歲。選擇胃低分化腺癌的新鮮組織12例作為研究組2，其中男6例，女6例，年齡43～75歲，平均61.5歲。選擇正常胃黏膜組織的新鮮組織12例作為新鮮對照組，其中男6例，女6例，年齡42～73歲，平均61.6歲。以上各組間在性別、年齡構成等因素的比較中無明顯差異。

1.2免疫組化檢測MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表達 切片及染色基于石蠟包埋后的組織。MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的濃縮液均購自蘇州睿贏生物公司，應用免疫組化SP法進行檢測。先行預實驗，由病理醫師觀察，選擇染色效果最理想的濃度用于正式實驗，即MMP-12是1∶300，VEGF-D是1∶200，VEGFR-3是1∶200。正式實驗由同一技師完成，一次性完成，做好質控工作，減少人為誤差。

1.3熒光PCR法檢測MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA的表達 研究組2和新鮮對照組中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA表達的檢測應用熒光PCR技術。引物設計及擴增程序的設定見表1、2。操作嚴格按實驗步驟完成，均由同一實驗師完成，并設陽性對照和陰性對照，做好質控工作。

表1 引物設計

1.4MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3免疫組化結果的判定 MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的陽性部位均為細胞質和(或)細胞膜，結果判定由病理醫師完成，選擇上皮細胞集中的2個熱點區進行觀察(400倍)。應用陽性細胞百分比和著色強度綜合判定。陽性細胞百分比：以0%、≤25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別評定為 0、1、2、3、4 分。著色強度：以無、淡黃、棕黃、棕褐色分別評定為 0、1、2、3 分。兩者相加，以最后評分作為最終判定分數，以≤3分為陰性，以>3分為陽性。

1.5MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3熒光PCR結果的判定 結果的判讀以通道的循環閾(Ct)值為未確定的(Undet)或Ct值大于30為陰性，以Ct值小于等于30的樣本為陽性，曲線為明顯的S型。

1.6統計學方法 數據應用SAS6.12分析完成，行χ2檢驗、t檢驗、線性相關分析和Kaplan-Meier生存分析。

2 結 果

2.1研究組1、對照組1～4組中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表達的比較 五組中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表達差別有統計學意義(P<0.01)，即對照組4、對照組3、對照組2、對照組1、研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表達陽性率有增高趨勢。見表3、圖1。

表3 各組MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表達陽性率比較〔n(%)〕

圖1 MMP-12、VEGF-D、VEGFR-3蛋白在胃低分化腺癌中陽性表達(IHC，×200)

2.2研究組2和新鮮對照組中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA的表達 兩組中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA表達陽性率差別有統計學意義(P<0.01)。見表4、圖2。

表4 研究組2和新鮮對照組MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA表達陽性率的比較〔n(%),n=12〕

1：內控曲線；2：陽性曲線圖2 MMP-12、VEGF-D、VEGFR-3 mRNA在胃低分化腺癌中陽性表達

2.3研究組1中不同臨床特征中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表達的比較 研究組1 MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3與淋巴結轉移和脈管累犯顯著相關。MMP-12的表達與細胞增殖指數、腫瘤最大徑和浸潤深度密切相關(P<0.01)。見表5。

2.4研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表達的相關性分析 研究組1中MMP-12和VEGF-D(r=0.41，P=0.041)、VEGF-D和VEGFR-3(r=0.46，P=0.021)之間均呈顯著正相關性。

2.5研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3表達的生存分析 患者均進行隨訪，隨訪截止的時間為3～60個月，平均16.9個月。研究組1中MMP-12(χ2=3.95,P=0.033)、VEGF-D(χ2=4.25,P=0.014)和VEGFR-3(χ2=4.95,P=0.004)的陽性率均與患者預后顯著相關(P<0.05)，即MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3高表達患者的預后差。

表5 研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3陽性率在不同臨床病理特征中的表達差別〔n(%)〕

3 討 論

胃癌的淋巴結轉移是主要轉移途徑，腫瘤細胞具有明顯的播散性，遷移性強，患者常伴有脈管癌栓〔4〕。胃低分化腺癌是腫瘤細胞分化差的表達，也是胃癌的重要病理形態學類型，腫瘤細胞分布彌漫，細胞體積小，腺管形成少，易于轉移和播散，臨床侵襲行為強。研究認為淋巴管和血管受累提示腫瘤轉移的可能性明顯增強〔5〕。與淋巴道轉移的相關蛋白近年受到學者重視，其中淋巴管生成是關注的熱點之一。VEGF-D是新認識的淋巴管生成因子，其cDNA序列包括419個堿基對，其表達的蛋白包含354個氨基酸殘基〔6〕。VEGF-D的受體是VEGFR-3。VEGFR-3被認為在機體發育中是必需的，尤其是在原始心血管系統的形成中有一定的作用。在惡性腫瘤形成時，VEGFR-3的分泌量明顯增多，主要與淋巴管內皮細胞增殖分化有關，且主要表達部位是淋巴管的內皮細胞〔7〕。VEGF-D/VEGFR-3是腫瘤間質淋巴管形成時的重要通路，可以促進淋巴內皮細胞的形成。新形成的淋巴管呈枝芽狀，以“出芽”的形式生長形成實性的條索狀結構，在淋巴液的沖擊和間質改建過程中形成有功能的淋巴管。由于新形成的淋巴管與腫瘤組織相鄰，且結構和功能不完善，腫瘤細胞在生長時易于侵入，對淋巴道播散起重要促進作用〔8，9〕。關于VEGF-D/VEGFR-3通路的影響因素也有學者關注。梁任技等〔10〕通過觀察非小細胞肺癌(鱗癌和腺癌)中MMP-12的表達，發現MMP-12能促進腫瘤的進展，同時可以促進VEGF-D的表達，認為二者可能對病變的形成有明顯的作用，二者的關聯性可能是治療的靶點。MMP家族中有多個成員，結構上有一定的同源性，其特征性結構是含有鋅和鈣離子。MMPs均能對細胞外基質、基底膜、Ⅳ型膠原、層黏連蛋白等間質成分進行溶解破壞，使腫瘤轉移的屏障破壞，腫瘤細胞易于遷移〔11〕。MMP-12是家族中的重要成員，是作為彈性水解酶被認識的，研究認為MMP-12可以降解細胞外基質和基底膜的所有成分，其基因定位于11q22.3，cDNA全長1 800 bp，活化的MMP-12是以54 kD的酶原分泌，在水解作用后產生有活性的酶，可以激活MMP-2和MMP-3，引起MMP-12水解的級聯反應〔12，13〕。近年研究認為MMP-12可能和脈管生成有一定關聯〔14〕。

本研究結果顯示研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表達顯著高于其他四組，正常胃黏膜、低級別、高級別、高-中分化腺癌、低分化腺癌中三者的表達有升高趨勢，提示三者是促進病變形成的重要蛋白因素。結果顯示低分化腺癌新鮮組織中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3 mRNA高于正常組織，提示蛋白和mRNA的表達有高度的一致性。結果顯示研究組1中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3與淋巴結轉移、脈管累犯有關，提示三者對促進腫瘤的轉移有明顯作用。相關性分析顯示研究組1中MMP-12和VEGF-D、VEGF-D和VEGFR-3均具有正相關性，提示MMP-12可能是VEGF-D/VEGFR-3通路的重要影響蛋白，也提示MMP-12與淋巴管新生的作用可能是通過調節VEGF-D起作用的。胃腺癌中可見淋巴管新生，這為腫瘤轉移提供了便捷的通路，腫瘤細胞易于播散，同時由于同質性黏附力的下降，腫瘤細胞易于離開原發病灶，進入脈管，并定植于異源性組織處形成轉移灶。本實驗結果顯示MMP-12的表達與細胞增殖指數、腫瘤最大徑、浸潤深度密切相關，提示MMP-12可以促進腫瘤細胞的生長和侵襲，也提示低分化腺癌中MMP-12的作用方式可能更多元化。MMP-12在腫瘤細胞中的表達高，對腫瘤的侵襲和作用強，與癌基因的作用類似，同時對間質的作用更明顯〔15〕。MMP-12還可能對腫瘤細胞周圍炎性環境的調控有一定作用，引起癌性間質的活躍增殖，對促進轉移可能與有一定意義〔16〕。本實驗的生存分析證實MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3的表達與生存時間(預后)有關，即三者高表達患者的預后較差，這可能臨床判斷預后一定的價值。

綜上，胃低分化腺癌中MMP-12、VEGF-D和VEGFR-3高表達且具有協同作用，對腫瘤的形成和進展有促進作用，MMP-12可能對淋巴管生成通路VEGF-D/VEGFR-3有一定的促進作用。