原發性肝癌患者血清miR-6861-5p水平及臨床意義

胡凌波 周仁杰

(浙江省臺州醫院肝膽胰外科，浙江 臺州 317000)

原發性肝癌和病毒性肝炎、肝硬化關系密切，是肝細胞發生的惡性腫瘤；原發性肝癌的病因和發病機制尚不十分明確〔1〕。原發性感染的發病率和死亡率比較高，對人類健康造成嚴重危害。原發性肝癌早期癥狀不明顯，不少患者被確診時已為原發性肝癌中晚期，錯過了治療的最佳時間，即使可以得到根治性的治療，5年內復發率仍比較高〔2〕。原發性肝癌病情發展可導致肝衰竭，晚期癌細胞增殖，向周圍組織及遠處器官擴散，惡化程度增加〔3〕。因此早診斷早治療可有效提高原發性肝癌的預后。miRNAs為非編碼小分子RNA，具有調控基因表達，可干擾轉錄和翻譯，從而對靶基因的表達進行調節，在惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用〔4,5〕。本文對原發性肝癌血清miR-6861-5p水平進行研究，探討其與原發性肝癌臨床病理特點的關系及其在診斷和預后預測中的價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇浙江省臺州醫院2010年1月至2013年12月原發性肝癌患者80例作為原發性肝癌組和健康體檢者80例作為對照組。原發性肝癌組年齡(61.24±12.41)歲，男52例，女28例；腫瘤直徑≥5 cm者43例，<5 cm者37例；TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期19例，Ⅲ22例，Ⅳ期14例；有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移55例；遠處轉移11例，無遠處轉移69例。對照組年齡(60.89±11.53)歲，男47例，女33例。原發性肝癌組和對照組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。

納入標準：原發性肝癌患者均為首診、進行手術治療的患者，且經病理證實為原發性肝癌，手術前未進行放化療及其他相關治療，所有研究對象簽署知情同意書。排除標準：重要臟器功能不全者，合并其他惡性腫瘤者，圍術期死亡者，臨床資料及隨訪資料不全者，術后無法接受隨訪及中途退出者。

1.2研究方法 血清miR-6861-5p水平測定：抽取原發性肝癌組和對照組患者外周血5 ml，采用miRNA提取試劑盒(購自HaiGene公司)提取總miRNA，對提取的miRNA進行反轉錄(反轉錄試劑盒購自HaiGene公司)，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定血清miR-6861-5p水平(儀器及試劑盒購自購自HaiGene公司)，PCR條件為95℃ 10 min，95℃ 30 s，55℃ 20 s，共42個循環，然后60℃ 1 min。以U6為內參照。miR-6861-5p上游引物為：5'-ACAC TCCA GCTG GGAC TGGG TAGG TGGG C-3'，下游引物為：5'-GTGC AGGG TCCG AGGT-3'。血清miR-6861-5p水平以2-ΔΔCT表示。

1.3隨訪 原發性肝癌患者術后采用電話或門診隨訪，隨訪時間從患者手術時間開始至隨訪截止時間或術后死亡時間，隨訪截止時間為2017年12月31日。

1.4統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗，血清miR-6861-5p水平對原發性肝癌的診斷價值采用受試者工作特征(ROC)曲線下面積分析，生存曲線采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗分析。

2 結 果

2.1原發性肝癌組和對照組血清miR-6861-5p水平比較 原發性肝癌組血清miR-6861-5p水平明顯高于對照組(1.87±0.21 vs 1.00±0.06，t=35.629,P=0.000)。

2.2血清miR-6861-5p水平與原發性肝癌臨床病理特點的關系 血清miR-6861-5p水平與原發性肝癌的TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關(P<0.05)，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、有遠處轉移者血清miR-6861-5p水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移和遠處轉移者；血清miR-6861-5p水平與年齡、性別、腫瘤直徑無關(P>0.05)，見表1。

表1 血清miR-6861-5p水平與原發性肝癌臨床病理特點的關系

2.3血清miR-6861-5p水平對原發性肝癌的診斷價值 ROC曲線顯示：血清miR-6861-5p以1.35為診斷閾值，診斷原發性肝癌的ROC曲線下面積為0.863(95%CI：0.860～0.866)，診斷敏感度為75%，診斷特異度為87%。見圖1。

2.4血清miR-6861-5p與原發性肝癌生存期的關系 以ROC曲線中血清miR-6861-5p的中位數值為界，高表達患者的無病生存期為(23.41±14.57)個月，總生存期為(34.82±10.48)個月；低表達患者的無病生存期為(32.15±15.36)個月，總生存期為(42.57±11.06)個月。miR-6861-5p低表達患者的無病生存期和總生存期均明顯高于高表達患者(P=0.011、0.015)。見圖2和圖3。

圖1 血清miR-6861-5p診斷原發性肝癌的ROC曲線

圖2 血清miR-6861-5p與原發性肝癌無病生存期的關系

圖3 血清miR-6861-5p與原發性肝癌總生存期的關系

3 討 論

原發性肝癌是惡性腫瘤相關性死亡的原因之一，隨著醫學水平的發展，原發性肝癌的早期診斷取得了一定進步，但由于原發性肝癌肝內轉移和侵襲的存在，預后仍比較差，且原發性肝癌的復發率高、容易轉移，使原發性肝癌的總生存期不是太理想〔6,7〕。因此尋找原發性肝癌的生物標志物在原發性肝癌的診斷、治療及預后預測中具有重要價值。

miRNA長度為20～25個核苷酸，為一類內源性的非編碼單鏈RNA，在真核細胞生物中廣泛存在〔8〕。人類miRNA在人類基因組中的比例比較小，約占1%，其中大約50%定位于染色體脆弱區，染色體脆弱區和人類癌癥的發生發展關系密切〔9〕。miRNA在細胞核中經過RNA聚合酶催化可轉錄成初級miRNA，初級miRNA長度約數千核苷酸，隨后被RNA酶識別并切割成前體miRNA，前體miRNA具有發夾結構，在核轉運蛋白5的作用下，轉運至細胞質內，被另一種RNA酶剪切成miRNA-miRNA二聚體，該二聚體結合Argonaute蛋白，激活反應RNA結合蛋白，然后被切割成兩條miRNA單鏈，其中一條單鏈游離出復合體，很快被降解，而另一條單鏈為成熟的miRNA，在RNA介導的沉默復合體形成中發揮重要作用；當miRNA完全綁定目標信使RNA時刻造成mRNA降解；當miRNA不完全綁定時可阻遏其轉錄，發揮基因沉默作用〔10〕。不同的miRNA對細胞的調控作用不同，在原發性肝癌中存在多種miRNA異常，參與原發性肝癌的發生發展過程〔11,12〕。

miRNA在外周血中有豐富的穩定表達，由于miRNA內源性結構特性決定了血清miRNA具有抗核糖核酸酶的能力，血清中miRNA即使經過pH值改變、反復凍融等仍可以維持穩定〔13〕。血清miRNA的穩定性使其被認為是最具潛力的惡性腫瘤生物標志物〔14〕。在原發性肝癌患者血清中存在多種miRNA水平異常，多種血清miRNA被證實在原發性肝癌的診斷、治療及預后預測中具有重要價值，為原發性肝癌的潛在腫瘤標志物〔15,16〕。

miR-6861-5p定位在人染色體12q24.13上，關于miR-6861-5p功能的研究不多，袁超〔17〕研究發現乳腺癌患者血清miR-6861-5p水平升高，是乳腺癌術前診斷、臨床分期、細胞轉移和術后檢測復發的潛在生物標記物；Shimomura等〔18〕研究發現乳腺癌患者血清miR-6861-5p水平高于健康女性，且血清miR-6861-5p與血清miR-1307-3p、miR-1246、miR-4634、miR-6875-5p聯合診斷乳腺癌的靈敏度為97.3%，特異度為82.9%；付紅偉等〔19〕研究發現乳腺癌患者血清miR-6861-5p水平升高，miR-6861-5p聯合CA153對乳腺癌具有比較高的診斷效能，可作為乳腺癌診斷的一種有效手段。本研究結果表明隨著原發性肝癌病情嚴重程度加重，血清miR-6861-5p水平升高，血清miR-6861-5p水平在判斷原發性肝癌病情嚴重程度和預后預測中也具有重要價值。