基于NF-κB通路探討鹿角壯骨膠囊對兔膝骨關節炎的保護作用機制

梁子聰 王恒 胡建山 陸瑞娜 胡先運

(1黔南民族醫學高等?？茖W校，貴州 都勻 558000；2黔南州中醫醫院；3黔南州人民醫院；4貴州醫科大學天然產物化學重點實驗室)

骨關節炎(OA) 是中老年人常見的致殘性疾病之一，全身各關節均可發病，其中膝關節發病率最高〔1〕。目前我國膝骨關節炎(KOA) 總體發病率約為18%，女性(約19%)高于男性(約11%)〔2〕。KOA的病因病機復雜，有研究顯示，KOA的發病與核因子(NF)-κB信號通路的激活關系密切，它通過轉導細胞外信號，調節多種基因表達，參與了KOA發病的免疫應答與炎癥反應、滑膜成纖維細胞增生、軟骨細胞外基質降解、軟骨細胞凋亡等多個環節〔3，4〕。KOA的早期治療以抗炎、鎮痛為主，但長期服用非甾體類抗炎藥會帶來諸多不良反應〔5〕。中醫藥治療KOA的療效良好，副作用少，具有廣闊的開發前景。黔南州中醫醫院研制的院內制劑鹿角壯骨膠囊，用于治療因肝腎不足引起的KOA已獲得不錯的臨床效果〔6〕。本實驗旨在觀察鹿角壯骨膠囊對NF-κB通路的影響，了解其對KOA的治療作用機制。

1 材料與方法

1.1儀器 JA10002型電子天平(上海精天)；DDIL-5型恒溫箱(上海安亭)；ASP300 S型全封閉式組織脫水機、RM2265型全自動輪轉式切片機、HI1210型攤片機、DM750型光學顯微鏡(德國Leica)；GelDoc型凝膠成像系統(美國BIO-RAD)。

1.2藥品與試劑 治療藥物鹿角壯骨膠囊由黔南州中醫醫院制劑科提供(批準文號：黔藥制2013003號，規格：0.45 g/粒)，木瓜蛋白酶(北京索萊寶)，封閉液(武漢博士德)，血管內皮生長因子(VEGF)、低氧誘導因子(HIF)-2α、NF-κB抑制蛋白(IκBα)、NF-κB p65、骨橋蛋白(OPN)一抗，通用型SP試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色盒(北京中杉金橋)，4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液由黔南州人民醫院病理科提供，其余試劑均為國產分析純。

1.3實驗動物與分組 普通級四月齡日本長耳白雌兔24只，體重(2.0±0.5)kg，由長沙天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2014-0010。適應性飼養1 w，分籠飼養，不限制飲食。24只兔隨機分為3組，分別為正常組、模型組、治療組(鹿角壯骨膠囊)，每組8只。

1.4造模 各組兔按3.5 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，待完全麻醉后，剪刀于右側膝關節內側附近備皮，顯露皮膚，碘伏、75%酒精棉簽反復消毒。1 ml注射器抽取提前配制好的4%木瓜蛋白酶溶液0.5 ml，微微彎曲膝關節，針尖分別在模型組與治療組兔內側膝眼進針，回抽確定進入關節腔后，緩慢注射，棉簽輕壓針眼，避免溶液溢出。正常組同法注射等體積滅菌注射用水。各組被動屈伸右側膝關節20次，促進溶液在關節腔內均勻擴散。間隔3 d重復一次，共注射3次。末次注射后，各組兔每天驅趕運動30 min，其余時間籠內自由活動。

1.5治療方法 首次注射后第2周，治療組給予鹿角壯骨膠囊藥粉0.3 g/kg(參照成人和實驗動物等效劑量〔7〕換算而得)，稱取體重的相應劑量，用蒸餾水稀釋成10 ml后灌胃，每天1次，連續給藥4 w。余組給予10 ml蒸餾水灌胃。

1.6動物取材 末次給藥第2天，麻醉處死所有實驗動物。切開關節囊，剔除軟組織，取下膝關節及滑膜標本，膝關節標本置于4%多聚甲醛中固定，滑膜組織置于液氮冷凍保存。

1.7觀察指標

1.7.1各組兔膝關節滑膜IκBα、NF-κB p65、OPN蛋白表達的檢測 采用Western印跡法檢測各組兔膝關節滑膜組織IkBα、NF-κB p65、OPN蛋白表達的情況。將滑膜標本剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小，細胞裂解法提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，收集上清液，提取等量蛋白，配置十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉，加入IκBα(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、OPN(1∶500)、β-actin(1∶2 000)一抗，4℃室溫搖床過夜，37℃復溫后加二抗(1∶1 000)孵育2 h，TBST漂洗，電化學發光(ECL)顯色，用β-actin做內參，Image J軟件計算條帶灰度值(目的蛋白相對含量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值)。

1.7.2各組兔膝關節軟骨VEGF、HIF-2α、NF-κB p65陽性表達的檢測 采用免疫組化法(SP)檢測各組兔軟骨組織VEGF、HIF-2α、NF-κB p65陽性表達的情況。按照免疫組化檢測試劑說明書操作：石蠟切片經60℃烘片1 h，入二甲苯脫蠟2次，每次10 min、梯度酒精(100% 3 min，90% 3 min，85% 3 min，75% 3 min，蒸餾水3 min，PBS 3 min)。將切片置于0.1 mol/L且pH=6.0的枸櫞酸液修復液中，用微波爐100火力3 min至微微沸騰，再用50火力維持7 min，停止加熱后自然冷卻20～30 min。用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min×3次。3%過氧化氫(H2O2)孵育10 min以消除內源性過氧化物酶活性。PBS沖洗，5 min×3次。滴加封閉液〔5%牛血清白蛋白(BSA)〕，在濕盒中室溫30 min。用濾紙擦去封閉液，勿洗。滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4℃孵育過夜(稀釋濃度：VEGF為1∶100，NF-κB p65為1∶150，HIF-2α為1∶200)，再用PBS 5 min×3次洗去一抗，用濾紙擦去標本外的PBS。滴加生物素化二抗工作液，室溫置濕盒中孵育20 min，用PBS 5 min×3次洗去二抗，用濾紙擦去標本外的PBS。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫置濕盒中孵育20 min，用PBS 5 min×3次洗去，用濾紙擦去標本外的PBS。DAB顯色劑顯色，自來水充分沖洗。再進行蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。每張組織切片在相同部位攝取3個視野(×400)。運用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件對圖片進行分析，計算相同面積內相關指標陽性表達的平均光密度值(平均光密度值=光密度值÷測量面積)。

1.8統計學處理 使用SPSS22.0軟件進行統計學處理。采用Shapiro-Wilk法作正態檢測，Levene法作方差檢測。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較若方差齊性采用LSD-t檢驗，方差不齊則采用Dunnet-t檢驗。

2 結 果

2.1各組兔膝關節滑膜IκBα、NF-κB p65、OPN蛋白表達的比較 與正常組比較，模型組兔膝關節滑膜IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Western印跡法檢測各組兔滑膜中IκBα、NF-κB p65、OPN蛋白表達

組別IκBα/β-actinNF-κB p65/β-actinOPN/β-actin正常組29.83±7.8140.59±5.2636.38±2.24模型組111.01±20.281)116.22±15.611)146.06±27.781)治療組77.45±18.281)2)74.97±10.711)2)92.69±7.891)2)

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；表2同

2.2各組兔膝關節軟骨VEGF、HIF-2α、NF-κB p65陽性表達的比較 與正常組比較，模型組兔膝關節軟骨VEGF、HIF-2α、NF-κB p65的表達明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組VEGF、HIF-2α、NF-κB p65的表達明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組兔軟骨VEGF、HIF-2α和NF-κB p65免疫組化陽性表達(IHC，×100)

表2 各組兔軟骨VEGF、HIF-2α和NF-κB p65免疫組化表達結果比較

3 討 論

KOA 是一種慢性進行性退行性疾病，病理過程包括了滑膜炎性增生、軟骨退變、骨贅形成等多個方面〔8〕。NF-κB可與多種基因的啟動子或增強子結合促進基因轉錄，是免疫與炎癥反應中的重要轉錄因子之一。相關研究表明，NF-κB蛋白家族存在于OA患者的多種細胞中，在滑膜組織、軟骨及軟骨下骨、關節液及周圍肌肉中均出現高表達〔9〕。NF-κB幾乎參與了OA發病的所有病理過程，因此通過抑制NF-κB途徑干預OA的發展，成為研究該疾病治療方法的新方向。正常情況下，胞內NF-κB二聚體(包括p65和p50兩組蛋白)被IκB隔離在細胞質中。當NF-κB通路被上游信號介導的分子激活時，IκB被磷酸化導致蛋白酶體降解，NF-κB蛋白被釋放，介導信號向細胞核內傳導。隨后，p65被磷酸化進入細胞核，進而促進或抑制特定基因的表達〔10，11〕。研究顯示，當NF-κB信號通路被激活時，可以快速誘導表達免疫和炎癥反應多個相關基因，其中包括細胞因子〔白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-17、環氧酶(COX)-2〕、基質金屬蛋白酶(MMPs)等，促進炎癥反應形成〔12〕。IL-1β、TNF-α、IL-17是OA發病的密切相關細胞因子，除了能刺激成纖維細胞增生外，還能促進軟骨細胞凋亡〔13〕。MMPs是降解細胞外基質的主要蛋白酶，MMPs表達增多時，軟骨細胞外基質將遭受進行性降解而被破壞〔14〕。

OPN作為細胞免疫的早期活化因子，可激活NF-κB信號通路，參與OA的發生、發展〔15〕。有研究報道，OPN在OA重度骨贅中出現高表達，并且表達量與OA的X線分期嚴重程度呈正相關，提示OPN可能在OA軟骨破壞、骨質增生過程中發揮重要作用〔16〕。敲除大鼠OPN后，其炎癥介質、細胞因子的生成被抑制，作用與NF-κB抑制劑相似〔17〕。OA促使軟骨中HIF-2α的表達增加，導致軟骨分解和軟骨內骨形成〔18〕。NF-κB作為HIF-2α的上游信號，與其表達水平密切相關〔19〕。實驗表明，OA小鼠軟骨細胞中HIF-2α水平的提高將加重關節軟骨細胞的凋亡，增強了Epas1和Fas基因的表達及軟骨的損傷，HIF-2α的高表達還可以誘導軟骨骨化，導致關節中心的軟骨退化并在軟骨邊緣形成骨贅〔20〕。HIF-2α還可通過上調靶基因促進VEGF的表達，加速OA的病變進程。VEGF參與了OA血管翳的形成，血管生成過程中可促進炎癥因子的釋放和感覺神經的生長，導致OA關節疼痛和腫脹加重〔21〕。Ludin等〔22〕用VEGF注射液在正常小鼠關節腔內注射，每周1次，數周后該關節出現骨贅形成，說明VEGF與OA骨贅形成相關。本實驗結果表明，與正常組比較，模型組兔膝關節滑膜中IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相對表達量明顯升高，軟骨中VEGF、HIF-2α、NF-κB p65的表達明顯升高，說明木瓜蛋白酶膝關節腔內注射可通過激活NF-κB信號通路誘導OA模型建立。與模型組比較，治療組關節滑膜中IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相對表達量明顯降低，關節軟骨中VEGF、HIF-2α、NF-κB的表達明顯降低，說明鹿角壯骨膠囊可能通過抑制NF-κB信號通路的激活發揮對OA的保護作用。

綜上所述，鹿角壯骨膠囊可通過抑制NF-κB信號通路的激活而發揮緩解KOA的作用。KOA的發病是多種炎癥介質誘導的結果，而NF-κB信號通路是其中的主要通路之一。鹿角壯骨膠囊還可能存在多通路相互作用，尚待進一步研究了解。