金蕎麥提取物對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)軟骨Caspase-1、3、9及MMP-1的影響

潘朝旺 王偉 萬進(jìn)軍 輯丹菊 秦玲麗

(1鄂州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 鄂州 436000；2鄂州市中心醫(yī)院；3武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是常見的退行性骨關(guān)節(jié)疾病，其特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性破壞，是中老年人常見、多發(fā)的關(guān)節(jié)病，目前其確切病因仍不明確，近年來研究提示OA的病理進(jìn)程與炎性細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及軟骨細(xì)胞凋亡有關(guān)〔1～3〕，本研究擬通過觀察金蕎麥提取物對(duì)膝OA兔血清和關(guān)節(jié)液白細(xì)胞介素(IL)-1β、前列腺素(PG)E2，軟骨組織半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-1、Caspase-3、Caspase-9、MMP-1及關(guān)節(jié)病理的影響，探討金蕎麥提取物治療膝OA的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物 金蕎麥提取物(每克相當(dāng)于原藥材20 g)，購自西安草翠芯生物科技有限公司(批號(hào)：20170623)；鹽酸氨基葡萄糖膠囊，浙江誠意藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)：20171016)。

1.2動(dòng)物 健康新西蘭大白兔，40只，雌雄各半，體重2.5～3.0 kg，由湖南省長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部提供，合格證號(hào)：HNACSDC20120853。

1.3試劑 兔MMP-1免疫組化試劑盒，上海雅吉生物科技有限公司；IL-1β、PGE2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，上海拜力生物科技有限公司；Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9試劑盒購自凱基生物科技公司(批號(hào)分別為：20180624、20180617、20180622)。

1.4儀器 OLYPUS BX-60光學(xué)顯微鏡，日本；9602A酶標(biāo)儀，南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器公司；病理切片機(jī)HS2046，金華市華速科技有限公司。

1.5動(dòng)物造模及分組給藥 取健康新西蘭大白兔32只，隨機(jī)挑選8只作為正常組，其余24只參照文獻(xiàn)〔4〕制備關(guān)節(jié)制動(dòng)OA模型：剪去左后肢膝關(guān)節(jié)上下4 cm的兔毛，從膝關(guān)節(jié)上下約各3.5 cm處用醫(yī)用石膏繃帶將左下肢伸直位固定，造模時(shí)間為6 w。 造模完成后，將模型動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組8只，即模型組、氨基葡萄糖組、金蕎麥提取物組。給藥：金蕎麥提取物組每天灌胃金蕎麥提取物0.56 g/kg，氨基葡萄糖組每天灌胃鹽酸氨基葡萄糖膠囊溶液0.09 g/kg，模型組和正常組每天灌胃生理鹽水5 ml，連續(xù)給藥28 d，末次給藥24 h后觀察以下指標(biāo)。

1.6ELISA法檢測(cè)血清IL-1β和PGE2 兔耳緣靜脈處取血約2 ml，3 500 r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存待用。按試劑盒說明采用ELISA法測(cè)定IL-1β和PGE2含量。

1.7ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液IL-1β和PGE2 將實(shí)驗(yàn)兔固定，使其左后肢膝關(guān)節(jié)盡量屈曲約90°，向膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入0.5 ml無菌生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，然后抽取關(guān)節(jié)腔沖洗液約0.4 ml，測(cè)定IL-1β和PGE2含量，方法同上。

1.8蘇木素-伊紅(HE)染色觀察膝關(guān)節(jié) 切取脛骨內(nèi)外髁全層關(guān)節(jié)軟骨，用10%的甲醛溶液固定，5%的硝酸反復(fù)脫鈣后制成石蠟切片,經(jīng)HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨和滑膜，并參照文獻(xiàn)〔5〕進(jìn)行Mankin評(píng)分。

1.9免疫組化法檢測(cè)軟骨細(xì)胞MMP-1 具體方法見試劑盒說明書，基本步驟為：烤片→脫蠟→水化→抗原修復(fù)→封閉→加一抗→洗滌→封閉→加二抗→洗滌→封閉→加HRP-SA→洗滌→顯色→復(fù)染→封片→觀察成像。

1.10ELISA法檢測(cè)軟骨組織Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9 取關(guān)節(jié)軟骨，剪碎，用生理鹽水1∶20勻漿，分別加入50 μl二硫蘇糖醇和5 μl熒光標(biāo)記底物YVAD(Caspase-1),DEVD(Caspase-3)，LEHD(Caspase-9)，37℃反應(yīng)1.5 h，405 nm下檢測(cè)含量。caspase活性計(jì)算方法：caspase活性%=(實(shí)驗(yàn)組OD值/正常組OD平均值)×100%。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血清IL-1β、PGE2比較 與正常組比較，模型組血清IL-1β、PGE2含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，氨基葡萄糖組和金蕎麥提取物組關(guān)節(jié)液IL-1β、PGE2含量明顯下降(P<0.05，P<0.01)，但比正常組明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組血清IL-1β和PGE2比較

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與正常組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.2各組關(guān)節(jié)液IL-1β、PGE比較 與正常組比較，模型組關(guān)節(jié)液IL-1β、PGE2含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，氨基葡萄糖組和金蕎麥提取物組關(guān)節(jié)液IL-1β、PGE2含量明顯下降(P<0.01)，但比正常組明顯升高(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表2 各組關(guān)節(jié)液IL-1β和PGE2比較

2.3各組膝關(guān)節(jié)HE染色比較 正常組大白兔骨膜完整無增生，軟骨細(xì)胞排列有序，表層完整光滑，潮線清晰,無炎細(xì)胞浸潤和增生。模型組軟骨細(xì)胞明顯減少，軟骨層變薄，潮線間斷或消失，炎細(xì)胞浸潤和增生明顯。金蕎麥提取物組和氨基葡萄糖組關(guān)節(jié)面欠光滑，骨膜有不同程度斷裂，軟骨細(xì)胞不同程度缺損、潮線模糊或消失等改變，但與模型組相比均有所減輕，其中氨基葡萄糖組骨膜纖維組織增生明顯。見圖1。

圖1 各組膝關(guān)節(jié)HE染色(×200)

2.4各組關(guān)節(jié)Mankin評(píng)分比較 與正常組比較，模型組Mankin評(píng)分明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，氨基葡萄糖組和金蕎麥提取物組Mankin評(píng)分明顯下降(P<0.01)，但比正常組明顯升高(P<0.01)。見表3。

2.5各組軟骨細(xì)胞MMP-1比較 與正常組比較，模型組MMP-1陽性率明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，氨基葡萄糖組和金蕎麥提取物組MMP-1陽性率明顯下降(P<0.05，P<0.01)，但比正常組明顯升高(P<0.01)。見表3，圖2。

2.6各組軟骨組織Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9比較 與正常組比較，模型組Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，氨基葡萄糖組和金蕎麥提取物組Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9明顯下降(P<0.05，P<0.01)，但比正常組明顯升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組Makin評(píng)分、MMP-1陽性率及軟骨組織Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9比較

圖2 各組軟骨細(xì)胞MMP-1陽性率比較(免疫組化，×200)

3 討 論

研究表明，多種炎性細(xì)胞因子與OA的病理變化密切相關(guān)，其中IL-1β被證實(shí)是OA發(fā)病中的關(guān)鍵因素〔6,7〕。IL-1β來源于巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等，是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因素和重要調(diào)節(jié)劑，參與OA病理發(fā)展過程。IL-1β可促進(jìn)透明軟骨特征性Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成，而抑制Ⅱ、Ⅸ型膠原蛋白合成，抑制蛋白多糖合成和軟骨細(xì)胞增殖，從而使軟骨變性，此外，IL-1β可促進(jìn)MMP合成與釋放，降解軟骨中基質(zhì)；還可刺激滑膜細(xì)胞合成一氧化氮(NO)和軟骨細(xì)胞合成PGE2，加重關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)。OA患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、單核細(xì)胞和滑膜細(xì)胞均可產(chǎn)生高水平的IL-1β，這種高水平的IL-1β可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡并導(dǎo)致滑膜炎性反應(yīng)，軟骨破壞程度與其增高程度一致。臨床研究表明，OA患者關(guān)節(jié)液中IL-1β明顯升高，經(jīng)過不同療程的藥物治療后，IL-1β明顯隨著治療時(shí)間的延長逐漸降低〔8〕，為IL-1β參與OA病理發(fā)展過程提供了臨床依據(jù)。PGE2作為一種重要介質(zhì)，也參與了OA病理發(fā)展過程，它和IL-1β、NO共同參與破壞軟骨基質(zhì)代謝，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增生或破壞軟骨，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性改變。本研究顯示，模型組血清和關(guān)節(jié)液IL-1β、PGE2含量明顯升高，而相應(yīng)的膝關(guān)節(jié)病理也顯示軟骨細(xì)胞明顯減少，軟骨層變薄，潮線間斷或消失，炎細(xì)胞浸潤和增生明顯，提示膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與IL-1β、PGE2有關(guān)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，膝OA模型兔在服用金蕎麥提取物后，血清和關(guān)節(jié)液IL-1β、PGE2含量明顯降低，膝關(guān)節(jié)病理也明顯改善，提示金蕎麥提取物可抑制它們對(duì)膝骨關(guān)節(jié)破壞作用。Caspase-1作為IL-1β轉(zhuǎn)化酶，能將IL-1β的前體加工成成熟的活性形式，是IL-1β激活的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，本研究結(jié)果也顯示Caspase-1在骨關(guān)節(jié)炎兔模型組明顯升高，正好與IL-1β的升高相對(duì)應(yīng)，金蕎麥提取物組和氨基葡萄糖組與模型組比較，Caspase-1明顯降低，提示金蕎麥抗OA作用可能與降低Caspase-1有關(guān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，OA關(guān)節(jié)軟骨退行性病變的原因是軟骨基質(zhì)膠原蛋白合成和降解失衡，其中Ⅱ型膠原蛋白是軟骨細(xì)胞基質(zhì)的主要成分，占軟骨干重60%，對(duì)于軟骨維持生物力學(xué)功能具有重要作用。MMP-1是一種膠原蛋白水解酶，可以直接降解Ⅱ型膠原蛋白，使軟骨得不到基質(zhì)保護(hù)而被破壞，因此，MMP-1在OA關(guān)節(jié)軟骨退變的過程中具有重要促進(jìn)作用，其活性高低在OA病理發(fā)展中起關(guān)鍵性作用〔9〕。研究表明，MMP-1在OA兔模型明顯增高，其活性與軟骨退變程度呈正相關(guān)〔10,11〕。本研究表明，金蕎麥提取物可明顯抑制骨關(guān)節(jié)炎兔模型軟骨組織MMP-1的產(chǎn)生，從而減輕其對(duì)軟骨組織的破壞，保護(hù)軟骨組織。研究表明，軟骨細(xì)胞凋亡與破壞OA關(guān)節(jié)軟骨完整性關(guān)系密切〔12〕。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自主有序死亡過程，Caspases是一組半胱氨酸蛋白酶家族，目前有不少于11種Caspase在人體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，其中有幾種在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)揮重要作用〔13〕，而Caspase-9參與了細(xì)胞凋亡的起始，Caspase-3則參與了細(xì)胞凋亡的執(zhí)行，它們通過級(jí)聯(lián)激活誘導(dǎo)特定細(xì)胞底物裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，OA兔模型組軟骨組織Caspase-3、Caspase-9明顯高于正常組，而藥物組在給藥后Caspase-3、Caspase-9明顯降低，提示金蕎麥提取物可明顯抑制OA兔模型軟骨凋亡。綜上，金蕎麥提取物可降低血清、關(guān)節(jié)液IL-1β、PGE2含量和軟骨Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9，抑制軟骨MMP-1表達(dá)，改善關(guān)節(jié)軟骨和滑膜病理形態(tài)。