高壓氧聯合化療對裸鼠食管癌組織中PTEN、HIF-1α表達的影響及作用機制研究△

魯志剛，賈慧瓊，張欣，魯艷

內蒙古醫科大學附屬醫院1胸外科，2高壓氧科，呼和浩特 010050

3內蒙古醫科大學生理學教研室，呼和浩特010010

食管癌是中國常見的一種消化系統惡性腫瘤，其發病率和病死率均高于世界主要發達國家水平[1]。高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）是臨床用于治療外傷、缺血、缺氧性疾病的常見手段[2]，過去由于擔心高氧分壓會促進腫瘤生長、導致腫瘤復發，HBO在惡性腫瘤中的應用起步較晚[3]。Feldmeier等[4]研究指出，HBO用于惡性腫瘤是安全的；后續研究指出，HBO甚至可能對某些惡性腫瘤亞型具有生長抑制作用，對腫瘤放射治療有增強作用[5]。因此，深入研究惡性腫瘤氧合作用及其增強放化療療效的機制十分必要[6]。目前，HBO對惡性腫瘤的作用研究已在乳腺癌、神經膠質瘤、血液腫瘤、結直腸癌及泌尿系腫瘤中開展[7]，但在食管癌中的研究較少。本研究建立了裸鼠食管癌模型，采用HBO聯合化療方式進行干預，觀察該聯合方式的治療效果，并對磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphate and tension homolog，PTEN）、缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表達情況進行分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c裸鼠40只，4～6周齡，體質量18～22 g，雌性與雄性裸鼠各20只，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；TE-1人食管癌細胞購自中國科學院昆明細胞庫。

1.2 食管癌模型建立

參考胡翠梨等[8]方法建立裸鼠食管癌模型，隨機選取30只BALB/c裸鼠采用皮下接種法向裸鼠右側腋部皮下注入甲基芐基亞硝胺（methyl-benzyl-nitrosamine，MBNA），每次3.5 mg/kg，每周2次，連續注射20周，建立食管癌大鼠模型。以瘤結節直徑達0.5 cm作為成瘤標準。選取30只食管癌成模裸鼠及10只同期飼養的健康裸鼠用于后續實驗。

1.3 實驗分組及治療方案

將同期飼養的10只健康裸鼠作為對照組，采用隨機數字表法將30只食管癌模型裸鼠隨機分為模型組、化療組、化療聯合HBO組（聯合組），每組10例。對照組與模型組裸鼠均給予5 ml/kg生理鹽水灌服，每天1次，共30天；化療組裸鼠給予4 mg/ml替加氟溶液灌服，5 ml/kg，每天1次，共30天；聯合組在化療組裸鼠的基礎上給予HBO治療（在應用化療藥物前進行），2.0絕對大氣壓穩壓吸氧60 min，每天1次，治療10天，停10天，再治療10天，共30天。

1.4 觀察指標及評價標準

治療結束后處死裸鼠，測量所有食管癌模型裸鼠的腫瘤大小，腫瘤體積=瘤體長徑×瘤體短徑2×0.5。取對照組裸鼠的正常食管黏膜組織和其他3組裸鼠的移植瘤組織，采用免疫組織化學半定量分析正常食管黏膜組織和移植瘤組織中PTEN、HIF-1α的表達情況。每張切片在高倍鏡（×400）下隨機選取5個具有代表性的視野拍照，使用圖像分析軟件IPP 6.0（image pro plus 6.0）進行光密度測量：選擇圖片上免疫組化反應物的黃色區域（排除細胞核上藍色的復染區域不會影響測量），然后測量這些區域的平均光密度（optical density，OD）值，取5個視野測量值的平均值。免疫組織化學法結果判定：細胞質或細胞核內出現棕黃顆粒為PTEN、HIF-1α表達陽性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤體積的比較

治療后，模型組、化療組、聯合組裸鼠的腫瘤體積分別為（47.20±4.43）、（25.45±3.79）、（20.40±4.47）cm3，三組間比較，差異有統計學意義（F=112.730，P＜0.01）。其中，化療組與聯合組裸鼠的腫瘤體積均小于模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；聯合組裸鼠的腫瘤體積小于化療組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 PTEN及HIF-1α表達水平的比較

對照組裸鼠正常食管黏膜組織和模型組、化療組、聯合組裸鼠的移植瘤組織中PTEN和HIF-1α的表達水平比較，差異均有統計學意義（F=29.549、23.788，P＜0.01）。模型組、化療組和聯合組裸鼠的移植瘤組織中PTEN的表達水平均低于對照組，HIF-1α的表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；模型組裸鼠的移植瘤組織中PTEN的表達水平低于化療組和聯合組，HIF-1α的表達水平高于化療組和聯合組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；化療組裸鼠的移植瘤組織中PTEN的表達水平低于聯合組，HIF-1α的表達水平高于聯合組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組別裸鼠中PTEN、HIF-1α表達水平的比較（±s）

表1 不同組別裸鼠中PTEN、HIF-1α表達水平的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與模型組比較，P＜0.05；c與化療組比較，P＜0.05

組別對照組（n=10）模型組（n=10）化療組（n=10）聯合組（n=10）0.386±0.102 0.053±0.011a 0.205±0.083a b 0.278±0.095a b c 0.032±0.019 0.313±0.121a 0.239±0.065a b 0.166±0.070a b c PTEN HIF-1α

3 討論

包括食管癌在內，各類型的實體瘤組織中均有不同程度的缺氧，而缺氧環境可以刺激腫瘤細胞分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），促進腫瘤新血管生成，因此缺氧可能促進惡性腫瘤的生物學演進[9]。相關研究指出，低氧環境可導致腫瘤細胞基因組的不穩定，使腫瘤細胞維持在未分化狀態，從而促進腫瘤細胞發生間充質轉化，提高腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[10]。因此，改善腫瘤微環境缺氧狀態成為近年來腫瘤治療的新手段，其中HBO是最常見而簡便的手段[11]。目前，HBO聯合放療或化療在食管癌治療方面的研究較少，臨床研究具體實踐參數資料缺乏，因此本文擬從動物實驗開始研究HBO對腫瘤微環境的影響，為后續HBO的臨床應用提供參考。

Yang等[12]研究發現，低氧刺激可以促進腎透明細胞癌細胞增殖，而通過miRNA-146a下調CADM2表達可以減緩腎透明細胞癌細胞的增殖速率。本研究結果顯示，化療組與聯合組裸鼠的腫瘤體積均小于模型組（P＜0.05），而聯合組裸鼠的腫瘤體積小于化療組（P＜0.05）。提示HBO聯合化療在裸鼠食管癌模型中可以有效縮小腫瘤體積，較單獨應用化療的療效更好。Qi等[13]研究表明，高氧分壓狀態下腫瘤細胞對化療藥物的敏感性增加。由于本研究僅對食管癌模型裸鼠進行了30天的HBO治療，明顯短于實際化療時間；而且本研究為預實驗，每組僅10只裸鼠，因此下一步還需要增加樣本量，進一步研究食管癌細胞對HBO聯合化療的敏感性[14]。

HIF-1廣泛存在于人和哺乳動物體內，由HIF-1α和HIF-1β兩種異源二聚體組成[15]，其中β亞基可以在細胞質中穩定表達，而α亞基在有氧條件下會被細胞內氧依賴性泛素蛋白酶快速降解，而缺氧環境中HIF-1α可穩定存在[16]。本研究結果顯示，各組裸鼠中HIF-1α的表達水平由高到低依次為模型組、化療組、聯合組及對照組，且組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示在HBO作用下，食管癌組織中氧分壓增高，可以降低HIF-1α的表達水平。Masoud和Li[17]研究指出，HIF-1可以促進VEGF基因轉錄，并增強VEGFmRNA的穩定性，從而促進腫瘤的新血管生成。因此，HIF-1可以間接減少腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長[18]。

PTEN基因位于第10號染色體，由9個外顯子組成，可編碼403個氨基酸，合成PTEN蛋白[19]。Shen等[20]研究表明，PTEN高表達可以降低HIF-1的穩定性。本研究結果顯示，各組裸鼠中PTEN的表達水平由高到低依次為對照組、聯合組、化療組及模型組，組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示HBO可以增強PTEN的表達，間接增加了對HIF-1表達的阻斷作用。此外，PTEN具有磷酸酯酶的活性，對黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）等磷酸化酶有拮抗作用，Jaraíz-Rodríguez等[21]研究發現，PTEN基因異常的膠質母細胞瘤細胞的FAK活性明顯增高；轉染野生型PTEN基因后，細胞的FAK活性明顯降低，而且腫瘤細胞的增殖、侵襲能力也均明顯降低。Kuchay等[22]研究發現，PTEN蛋白還可以通過抑制肌醇三磷酸（inositol triphosphate，IP3）的活性，間接地抑制胰島素（insulin）/IP3/磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）細胞生長信號通路的活性。上述研究表明，PTEN蛋白可能是一種作用廣泛的腫瘤抑制因子。

綜上所述，HBO聯合化療可以上調食管癌裸鼠模型腫瘤組織中PTEN的表達，同時下調HIF-1α的表達，提高化療藥物對食管癌的殺滅效果。