RECK、MMP9蛋白在三陰性乳腺癌中的表達及與患者臨床特征及預后的關系

周寧，譚曉殊，許婷婷，王帆榮，胡書婭

四川綿陽四〇四醫院病理科，四川綿陽621000

三陰性乳腺癌占全部乳腺癌類型的20%[1]，是乳腺癌的亞型之一，其雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表達均為陰性，好發于50歲以下年輕女性，遠處轉移和復發率高，預后較差[2]。基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）可分解基底膜中的纖維連接蛋白和層粘連蛋白，促進腫瘤細胞遷移[3]，Kazal基序富含半胱氨酸的逆轉誘導蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）是一種基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）抑制劑，在抑制腫瘤細胞遷移、侵襲等過程中有重要作用[4-5]。目前，RECK、MMP9在三陰性乳腺癌發生發展中的作用尚不清楚，因此，本研究探討RECK、MMP9在三陰性乳腺癌中的表達情況及其與患者臨床特征和預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2017年1月四川綿陽四〇四醫院收治的三陰性乳腺癌患者。納入標準：均經病理活檢確診為三陰性乳腺癌；既往未接受過手術和放化療治療。排除標準：合并其他臟器功能障礙；合并炎性乳腺癌或其他部位惡性腫瘤。依據納入和排除標準，本研究共納入43例三陰性乳腺癌患者，年齡32～65歲，平均年齡為（35.14±5.87）歲，≥45歲29例，＜45歲14例；腫瘤直徑：≤2 cm 23例，＞2 cm 20例；淋巴結轉移27例，無淋巴結轉移16例；組織學分級：G1級11例，G2級25例，G3級7例；TNM分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期20例，Ⅲ期6例。同期選取了43例健康體檢者，年齡30～69歲，平均年齡為（35.74±6.03）歲。兩組受試者年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組化染色方法

取三陰性乳腺癌患者的三陰性乳腺癌組織標本和對照組受試者正常乳腺組織標本，常規切片5 μm、脫蠟。組織切片放入pH=8.0的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）修復液中，高壓鍋內高壓2.5 min，3%過氧化氫室溫孵育20 min，正常兔血清封閉非特異性抗原15 min。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗后，加入鼠抗人MMP9單克隆抗體和RECK多克隆抗體，37℃孵育60 min，4℃放置過夜。PBS沖洗3次，加入二抗，37℃孵育40 min，PBS沖洗3次，滴加鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）溶液，37℃放置 30 min，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察RECK、MMP9蛋白的染色情況，選取PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定

RECK、MMP9蛋白主要定位于細胞質，以細胞質呈棕黃色顆粒判定為細胞陽性。依據著色強度進行評分：無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；依據陽性細胞所占比例進行評分：陽性細胞所占比例＜10%計0分，陽性細胞所占比例為10%～25%計1分，陽性細胞所占比例為26%～50%計2分，陽性細胞所占比例為51%～75%計3分，陽性細胞所占比例＞75%計4分。將著色強度和陽性細胞所占比例評分相加，總分＜3分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

1.4 隨訪方法

采用電話隨訪和門診復診的方式，對所有三陰性乳腺癌患者進行隨訪，隨訪截止時間為2019年5月，無失訪病例。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件對所有數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，等級資料的比較采用秩和檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RECK、MMP9蛋白表達情況的比較

三陰性乳腺癌組織中RECK蛋白的陽性表達率為32.56%（14/43），明顯低于正常乳腺組織的93.02%（40/43），差異有統計學意義（χ2=33.644，P＜0.01）。三陰性乳腺癌組織中MMP9蛋白的陽性表達率為88.37%（38/43），明顯高于正常乳腺組織的6.98%（3/43），差異有統計學意義（χ2=57.100，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中RECK、MMP9蛋白的陽性表達情況

不同TNM分期、組織學分級、淋巴結轉移情況三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中RECK蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（Z=6.479、10.689，P＜0.05；χ2=4.669，P＜0.05）；不同年齡、腫瘤直徑三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中RECK蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同淋巴結轉移情況三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中MMP9蛋白陽性表達率比較，差異有統計學意義（χ2=6.749，P＜0.05）；不同年齡、腫瘤直徑、TNM分期和組織學分級三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中MMP9蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中RECK、MMP9蛋白的陽性表達情況（n=43）

2.3 RECK、MMP9蛋白表達的相關性分析

Spearman秩相關分析結果顯示，RECK蛋白與MMP9蛋白表達呈負相關（r=-0.527，P＜0.05）。

2.4 RECK、MMP9蛋白表達情況與三陰性乳腺癌患者預后的關系

43例三陰性乳腺癌患者隨訪6～30個月，中位隨訪時間29個月，復發21例，死亡3例。隨訪30個月時，RECK蛋白陽性表達三陰性乳腺癌患者的無進展生存率為71.4%，高于RECK蛋白陰性表達患者的31.0%，差異有統計學意義（χ2=5.820，P＜0.05）；MMP9陽性表達三陰性乳腺癌患者的無進展生存率為36.8%，低于MMP9陰性表達患者的100%，差異有統計學意義（χ2=4.935，P＜0.05）。（圖1、圖2）

圖1 RECK陽性表達（n=14）和RECK陰性表達（n=29）三陰性乳腺癌患者的無進展生存曲線

圖2 MMP9陽性表達（n=38）和MMP9陰性表達（n= 5）三陰性乳腺癌患者的無進展生存曲線

3 討論

乳腺癌是一種異質性腫瘤，包括Luminal A型、Luminal B型、HER2過表達型和basal-like型。不同類型的乳腺癌具有不同的臨床特征和分子生物學特征，對治療的反應和預后也不盡相同。三陰性乳腺癌患者因ER、PR、HER2均為陰性表達而不適用于內分泌治療和靶向治療[6-7]，組織學分級和侵襲性更高，復發率和病死率較其他類型的乳腺癌更高[8-9]。

RECK是一種轉化抑制基因，可在轉錄后水平抑制MMP9的表達，也可通過抑制MMP9的分泌來抑制腫瘤細胞侵襲、轉移和新生血管生成[10-12]。RECK基因也可抑制上游啟動子與轉錄因子特異性位點的結合，抑制細胞的不典型增生和癌變[13-14]。RECK在正常組織中表達水平較高，但在食管癌、胃癌、膽管癌、胰腺癌等多種上皮源性腫瘤組織中表達明顯降低或缺失，在系統性紅斑狼瘡等免疫系統疾病組織中表達水平也較低。本研究結果顯示，三陰性乳腺癌組織中RECK蛋白的陽性表達率為32.56%，明顯低于正常乳腺組織的93.02%，差異有統計學意義（P＜0.01），與張靖[15]、Bravaccini和Maltoni[16]的研究結果一致，表明RECK表達缺失可能參與了三陰性乳腺癌的發生發展過程。研究顯示，子宮內膜癌組織中RECK的陽性表達率較低，且隨著臨床分期的增高而逐漸降低[17-18]，表明RECK在惡性腫瘤發生發展中扮演關鍵的角色。本研究結果顯示，不同TNM分期、組織學分級、淋巴結轉移情況三陰性乳腺癌患者三陰性乳腺癌組織中RECK蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），表明RECK表達水平較低或缺失可能與三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲等生物學行為密切相關。為了解RECK與三陰性乳腺癌患者預后關系，本研究通過長期隨訪發現，RECK蛋白陽性表達三陰性乳腺癌患者的無進展生存率為71.4%，高于RECK蛋白陰性表達患者的31.0%，差異有統計學意義（P＜0.05），表明可通過檢測RECK的表達情況預測三陰性乳腺癌患者的預后，為臨床治療提供參考。

MMP是高度保守內肽酶，能降解基底膜和細胞外基質所有蛋白，MMP9屬于MMP家族成員，具有MMP結構特點，可通過降解明膠和Ⅳ型膠原破壞基底膜完整性，有助于腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移[19-20]。腫瘤組織中MMP9的表達水平較高，方明等[3]分別觀察三陰性乳腺癌組織、乳腺增生組織和正常乳腺組織中MMP9表達的差異，結果顯示，三陰性乳腺癌組織中MMP9的陽性表達率最高，且MMP9陽性表達與三陰性乳腺癌淋巴結轉移情況有關，與本研究結果一致。吳鳳蘭[10]的研究結果顯示，RECK蛋白表達下調，可減弱對MMP9的抑制作用，從而促進腫瘤細胞的浸潤和轉移。本研究結果顯示，RECK與MMP9的表達呈負相關，表明RECK和MMP9可能在三陰性乳腺癌的發生發展中存在關聯機制，臨床可通過上調RECK的表達，抑制MMP9的表達，從而抑制腫瘤細胞的遷移和轉移等過程，達到抗腫瘤治療的目的。預后分析發現，MMP9同樣與三陰性乳腺癌患者預后密切相關，MMP9陽性表達三陰性乳腺癌患者無進展生存率為36.8%，低于MMP9陰性表達患者的100%，差異有統計學意義（P＜0.05），這與RECK和MMP9表達呈負相關的結論一致。臨床應重視MMP9表達水平較高的惡性腫瘤患者，積極采取措施抑制腫瘤進展，加強隨訪和干預，以積極改善患者預后。但本研究樣本例數較少，可能導致結果偏倚，應在以后研究中進一步擴大樣本量，增加觀察指標，為三陰性乳腺癌診療提供更可靠參考。

綜上所述，三陰性乳腺癌組織中RECK的表達水平較低，MMP9的表達水平較高，RECK蛋白的表達可能與三陰性乳腺癌患者的TNM分期、組織學分級和淋巴結轉移情況有關，MMP9蛋白的表達可能與淋巴結轉移情況有關。RECK蛋白陰性表達和MMP9蛋白陽性表達的三陰性乳腺癌患者預后較差。