MiR-132在大鼠腎間質纖維化模型中的表達及意義

謝媚媚 蘇震 羅勝男

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是多種病因導致的慢性腎臟病進展為腎功能衰竭過程中腎組織發生的主要病理改變[1]。RIF的發生機制非常復雜，至今仍未完全明確。microRNA（miRNA）是一類非編碼單鏈小RNA，長約18～24個核苷酸，與靶基因配對引起其降解或抑制其翻譯，進行轉錄后調控[2]。miRNA參與細胞凋亡、增殖、分化及炎癥、免疫反應等重要的生理病理過程[3]。單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）能很好地模擬RIF過程，是經典的RIF造模方法。高通量測序又稱下一代測序（next generation sequencing，NGS）[4]，常用于研究 miRNA。本研究使用NGS和實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測miR-132在UUO大鼠腎臟中的表達情況，并進行Gene Ontology（GO）分析和Pathway分析預測其靶基因，探討miR-132是否參與RIF的發生、發展，為臨床治療RIF提供新的靶點。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠購于上海中科院；Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒及熒光定量試劑盒（SYBR Green I）購于日本東洋紡公司；RT-qPCR引物由上海Invitrogen公司設計并提供；PCR儀購于德國艾本德公司；RT-qPCR儀購于美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 UUO模型的建立及病理檢查 將24只雄性SD大鼠隨機分為模型組和假手術對照（sham）組，每組12只。采用10%水合氯醛0.4g/kg腹腔注射麻醉大鼠，游離左側輸尿管至腎盂處，模型組建立UUO模型，即在近腎盂處和輸尿管上1/3水平處用0號線結扎并切斷輸尿管，sham組僅游離左側輸尿管而不結扎、切斷輸尿管，逐層縫合腹壁。術后兩組大鼠在相同條件下飼養，自由進食以及飲水，于術后第1、3天采用頸椎脫臼法分批（每批6只）處死獲取腎臟組織標本。大鼠腎組織行Masson染色評估RIF程度。

1.2.2 NGS及小RNA分析 術后第1、3天模型組大鼠采用Trizol法提取手術側和對側腎組織的總RNA（確定RNA濃度及鑒定純度采用紫外分光光度法），兩側分別取等量RNA進行混合，從中分離出小RNA，再逆轉錄成cDNA，進行PCR擴增后制成文庫，使用Solexa測序法，采用Illumina Hiseq 2000測序儀測序。測序后的序列使用miRBase15.0數據庫進行注釋，將miR-132表達量歸一化后計算fold-change值，公式為log2手術側/非手術側。本步驟委托華大基因中心完成。

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-132的相對表達量 采用Trizol法提取術后1、3d模型組和sham組的總RNA，使用特異性莖環引物進行逆轉錄反應，反應體系20μl，包括總 RNA 3μg、Oligo（dT）18 2μl、M-MLV 逆轉錄酶 1μl、RNase inhibitor 1μl、dNTP 1μl、DEPC 水加至20μl。反應條件為 16℃ 30min，42℃ 30min，70℃ 15min，結束后反應產物于-20℃保存。RT-qPCR采用SYBR Green 法，反應體系 20μl，其中前向引物 1.5μl、反向引物 1.5μl、 逆 轉 錄 產 物 1μl、plus solution 2μl、SYBR Green I Master mix 10μl、雙蒸水加至 20μl。反應條件為95℃ 120s預變性，95℃ 15s變性，60℃ 60s退火延伸，40個循環，所有樣品均作3個復孔。采用2－ΔΔCt法計算相對表達量[5]，miR-132以U6為內參。ΔΔCt=[Ct miR-132（模型組）－Ct內參（模型組）]－[Ct miR-132（sham 組）-Ct內參（sham 組）]，sham 組的 ΔΔCt為 0[6]。

1.2.4 GO和Pathway分析 選擇Targetsan 5.1數據庫預測miR-132的靶基因。基于GO和KEGG數據庫，對預測的靶基因分別進行GO注釋（功能注釋）和Pathway（信號通路）注釋，而后采用 χ2檢驗和 Fisher’s精確檢驗，計算GO以及Pathway的顯著性水平（標準為P＜0.05），得到具有顯著性意義的GO和Pathway注釋，然后從中挑選出可能與RIF有關的GO和Pathway注釋，取兩者所屬靶基因的交集，獲得具有顯著性意義的靶基因。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。正態分布的計量資料以表示，方差不齊者比較采用非參數Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎組織Masson染色結果 sham組術后第1、3天腎組織未見異常。模型組術后第1天腎單位和間質基本正常，術后第3天腎小管管腔輕度擴張，間質輕度水腫，可見散在間質單個核細胞浸潤，腎小球結構尚正常，見圖 1（插頁）。

2.2 NGS分析miR-132差異表達 與非手術側相比，手術側術后第1、3天均表達上調（均P＜0.01），術后第3天上調幅度較術后第1天大，見表1。

表1 NGS分析miR-132差異表達

2.3 RT-qPCR檢測miR-132的相對表達量 術后第1天模型組miR-132相對表達量為6.17±0.67，sham組為1±0；術后第3天模型組miR-132相對表達量為8.21±0.54，sham 組為 1±0；與 sham 組相比，術后第 1、3天模型組miR-132表達均明顯上調（均P＜0.05），且術后第3天上調幅度較術后第1天大。

2.4 GO和Pathway分析結果 經Targetsan 5.1數據庫預測靶基因后，得到226個靶基因，對其進行GO和Pathway注釋取交集后，得到9個有顯著性意義的靶基因，分別為 Ep300、Ⅱ1a、Rras2、Ppp2r5e、Ccng1、Capn2、Ccl25、Ocln、Nrcam。

3 討論

近年來miRNA成為研究臟器纖維化的熱點，包括肝臟纖維化[7-8]、心臟纖維化[9-10]、肺纖維化[11-12]等。Mann等[13]發現miR-132作為甲基化CpG結合蛋白2（methyl-CpG binding protein 2，MeCP2）的翻譯抑制物而參與肝臟纖維化發生，目前鮮有文獻報道miR-132與RIF之間的關系。

本研究中模型組術后第1天腎組織結構未見明顯病變，術后第3天被認為處于RIF早期階段，sham組未見異常。與sham組相比，術后1、3d模型組miR-132表達上調，相同時間點與非手術側相比，手術側miR-132表達上調，兩項結果都顯示術后第3天的上調幅度較術后第1天大，提示miR-132表達上調可能參與早期RIF的發生、發展。

本研究中miR-132經預測、分析得到9個靶基因，其中Ep300在小鼠視交叉上核中證實是miR-132的靶基因[14]。Ep300是E-鈣黏附蛋白的轉錄激活因子，Ep300下調可以使E-鈣黏附蛋白表達下調，激活上皮間質細胞轉分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程[15]，而EMT是腎臟間質纖維化發生、發展的關鍵環節。Ⅱ1a所編碼的是IL-1，涉及多種炎癥、免疫反應，IL-1通過調節TGF-β表達與生物活性而調控EMT[16]。Rras2編碼的蛋白在控制細胞增殖的信號轉導通路中起著重要的作用。Sharma等[17]報道Rras2通過激活Raf/MAPK通路介導NIH3T3成纖維細胞的轉化。

Ppp2r5e是調節細胞調亡的重要因子。Ppp2r5e在人胃癌組織中表達下調，被認為是miR-23a的靶基因，通過促進凋亡來抑制胃癌細胞的生長。Ccng1編碼的細胞周期蛋白G1參與細胞凋亡與增殖、DNA損傷修復等多種生理過程，Li等[18]發現Ccng1是miR-9的下游靶基因，在卵巢癌化療耐藥細胞中表達明顯上調。

Capn2編碼的鈣蛋白酶2參與細胞骨架重塑，細胞信號轉導，細胞增殖，細胞周期的進展，細胞凋亡等生理活動，Chen等[19]研究發現在人肝癌細胞中下調Capn2基因可以減少基質金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）的分泌，MMP-9可降解多種細胞外基質蛋白。Ccl25通過對骨髓源性肝干細胞具有趨化作用而參與肝臟纖維化發生、發展過程。Ocln編碼的緊密連接蛋白，是細胞間緊密連接的重要組成部分，在緊密連接的結構和功能維持中起著重要作用。Nrcam編碼的神經細胞黏附分子能介導細胞間和細胞與細胞外基質間的黏附作用。

在具體的GO注釋中，Ⅱ1a正向調節血管再生；Capn2參與缺氧應答；Ep300參與缺氧應答、調節膠原蛋白生物合成。在具體的Pathway注釋中，Ep300參與TGF-β信號通路；Rras2、Ⅱ1a參與MAPK信號通路；Il1a、Capn2參與細胞凋亡通路。以上功能注釋和參與的信號通路與腎間質纖維化的發病機制相關。

綜上所述，筆者推測miR-132表達上調可能通過以上靶基因參與激活EMT、細胞凋亡、減少細胞外基質蛋白降解等過程而參與早期RIF的發生、發展，且可能是RIF進展中的一個促進因子。進一步研究需對預測的miR-132靶基因進行鑒定。