正交試驗設計優選肝纖顆粒水提工藝*

盧雪盈 ，彭怡文 ，姜新根 ，王玉梅 ，趙金花 ，張尚斌 ，陳劍平 ，胡世平 △

（1.廣東省深圳市龍崗區中醫院，廣東 深圳 518172； 2.廣東省深圳市中醫院·深圳市醫院中藥制劑研究重點實驗室，廣東 深圳 518033）

肝纖方又名益肝化瘀方，是深圳市龍崗區中醫院胡世平主任醫師的臨床經驗方，具有疏肝理氣、活血化瘀、健脾祛濕的功效，主要用于治療慢性肝纖維化、慢性肝病及終末期肝病，對兼有濕濁、血瘀等證療效顯著。為了方便服用并保證原方療效，醫院將其進一步研制成質量可控的中藥顆粒劑。本研究中先確定醋鱉甲的先煎工藝，再采用正交試驗對提取工藝進行優化。由于丹參中的丹酚酸B具有抗纖維化作用[1]，故以丹酚酸B為含量測定指標，并綜合總固形物質量為評價指標?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜（HPLC）儀，包括柱溫箱、自動進樣器、二極管陣列檢測器、LC solution色譜工作站（日本島津公司）；AUW220D型電子天平（十萬分之一，日本島津公司）；CQ-250-DST型超聲波清洗機（上海躍進醫用光學器械廠）；LD5-2A型低速離心機（北京京立離心機有限公司）。

1.2 試藥

柴胡、當歸、赤芍、白芍、醋莪術、醋鱉甲、丹參、醋香附、黨參、麩炒蒼術、白術、茯苓、澤瀉、黃芪、垂盆草、葉下珠、醋青皮、陳皮（深圳華輝藥業有限公司，批號分別為 171104，20171102，17061001，17112901，17110601，17091001，17121001，1711083，17112601，20171018，171101，171101，1704001，20171202，170901，17051101，170701，1709030302），均經深圳市中醫院張尚斌主任中藥師鑒定為正品；丹酚酸B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為 111562-201716，含量以94.1% 計）；乙腈為色譜純（默克公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 先煎提取工藝考察[2]

因方中含有醋鱉甲藥味，按傳統工藝煎煮提取要求，需對其進行先煎考察。故本研究中采用單因素考察法，加水單煎醋鱉甲制得先煎考察樣品，以水溶性固形物質量為評價指標，分別對藥材粉碎粒度和提取時間進行考察。

水溶性固形物質量的測定[3]:精密量取各樣品溶液50 mL，置已恒重的蒸發皿中，100℃水浴蒸干，于105℃干燥至恒重。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0831干燥失重測定法測定，計算固形物含量。

固形物含量（%）=（50 mL濃縮液中固形物質量×250）／（醋鱉甲質量 ×250）×100%

不同粉碎粒度的醋鱉甲單煎考察:取醋鱉甲的飲片、最粗粉、粗粉、中粉各50g，精密稱定，分別加水500mL，煎煮1 h，過濾，濃縮，定容至250 mL，測定水溶性固形物質量，計算固形物含量。結果飲片煎煮所得固形物含量較低（8.21% ），最粗粉（10.19% ）、粗粉（9.88% ）、中粉（10.95%）的固形物含量差異不大。

不同煎煮時間單煎考察:取醋鱉甲最粗粉5份，各50 g，精密稱定，加水 500 mL，分別煎煮 0.5，1.0，1.5，2.0 h，過濾，濃縮，定容至250 mL，測定水溶性固形物質量，計算固形物含量。結果固形物含量分別為 10.19%，10.82% ，10.72%，10.43%。可見，煎煮 0.5 h 后對固形物含量的影響差異不大。

綜合固形物含量及時間成本等因素，醋鱉甲先煎提取優選工藝的粉碎粒度為最粗粉，先煎時間為0.5h。

2.2 水提取工藝考察

2.2.1 因素水平

根據前期預試驗結果，分別以加水倍數（因素A）、提取次數（因素B）、煎煮時間（因素C）為考察因素，每個因素各取3個水平，采用L9（34）正交試驗法，以丹參中丹酚酸B含量和總固形物質量為評價指標，進行優選。因素水平設計見表1。

表1 因素水平表

2.2.2 樣品制備

按優選的先煎工藝條件，對醋鱉甲進行先煎提取，在醋鱉甲先煎提取液與藥渣中，加入丹參、黃芪等17味藥材，按表1所示正交試驗因素水平表進行提取，濾過，合并濾液，濾液全部濃縮至約300 mL，用少量蒸餾水清洗濃縮鍋多次，全部轉移至500 mL容量瓶中，定容，搖勻，取適量濃縮液，4500 r／min離心5 min，取上清液，測定丹酚酸B含量和總固形物質量。

2.2.3 總固形物測定[4]

精密量取樣品50 mL，置已恒重的蒸發皿，在水浴上蒸干后，參照2015年版《中國藥典（四部）》通則2201浸出物測定法，于105℃下干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，立即稱定質量，按公式計算總固形物含量。

總固形物質量（g）=（50 mL濃縮液中固形物質量／g×500 mL）／50 mL

2.2.4 丹酚酸B含量測定

色譜條件[5]:色譜柱為InertsilODS-SP柱（150mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈 -0.1% 磷酸溶液（22 ∶78，V／V）；流速為 1.2 mL ／min；二極管陣列檢測器，檢測波長為286 nm。

溶液制備:取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加80%甲醇溶解并制成每1 mL含丹酚酸B約1 mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。取2.2.2項下的樣品溶液適量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按優選的先煎工藝條件，對醋鱉甲進行先煎提取，在醋鱉甲先煎提取液與藥渣中，加入黃芪等16味藥材（除丹參外），加10倍量水，提取2次，每次2 h，制得不含丹參的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

專屬性試驗:取上述3種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果陰性對照品溶液色譜中，在與丹酚酸B、供試品溶液色譜相應位置上無色譜峰出現，表明方法專屬性良好（見圖1）。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:精密吸取對照品溶液（1060μg／mL），加 80% 甲醇制成每 1 mL 含 1000，800，600，400，200，100，80，60，40，20 μg 的溶液。按擬訂色譜條件進樣，測得峰面積。以進樣量（，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=1065 467.411-23845.970，r=0.9999（n=10）。結果表明，丹酚酸 B進樣量在 0.1036 ～4.1440 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度、重復性、穩定性及回收率試驗:按相關方法進行操作，結果精密度、重復性、穩定性（24 h）試驗結果的RSD均小于2.0%（n=6），平均加樣回收率為98.85%，表明該方法穩定、可行。

2.2.5 水提正交試驗結果

采用綜合加權評分法[4]，以總固形物質量和丹酚酸B含量9次試驗的最大值為100分，將各指標成分的總量轉換為評分值，考慮到丹參在處方中為君藥，故總固形物質量和丹酚酸B含量的加權系數分別設為0.5，進行綜合評價，篩選最佳工藝。結果見表2和表3。

表2 正交設計試驗結果

可見，提取條件以A3B3C3為佳。方差分析結果表明，提取次數對丹酚酸B含量和總固形物質量具顯著性差異，且差異主要來源于第1水平與第2水平，而第2水平與第3水平差異不顯著，故選擇第2水平，即提取2次。綜合考慮，各因素影響水平為提取次數（B）＞加水量（A）＞提取時間（C），綜合考慮到縮短生產周期、降低生產成本等，故確定優選提取工藝為黃芪、丹參等17味藥材，加10倍量水，提取2次，每次1 h。

2.3 驗證試驗

為驗證水提工藝的可行性，進行3批重復驗證試驗。每批稱取黃芪、丹參等18味藥材，照先煎工藝優選結果和正交試驗最佳提取工藝條件進行提取，并測定水提液中丹酚酸B和總固形物質量，計算綜合評分值。結果見表4?？梢?，3次平行試驗的干膏得率的平均值為31.25%，平均綜合評分為95.20分，與正交試驗綜合評分最大值的結果接近，提示所篩選的提取工藝條件基本穩定。

表4 優選提取工藝驗證試驗結果

3 討論

3.1 提取工藝設計

肝纖方中有多味含揮發油成分的中藥，但收集以水提取的揮發油量較少，根據揮發油提取預試驗結果及處方中揮發油的性質分析，可能由于揮發油含量低、不穩定、水溶性大[3]等因素，將所有藥材直接用水提取，成本低、安全性高，且與傳統工藝相契合[6]。

本研究中采用單因素試驗法考察醋鱉甲先煎工藝、以正交試驗法考察水提工藝，2種方法結合研究該處方的提取工藝，一方面可明顯縮短研究的時間，降低研究成本；另一方面可保證原方的提取效果[7]，盡可能與傳統工藝保持一致，從而為充分發揮臨床療效提供基礎。采用正交試驗進行水提工藝優化，綜合考慮提取過程的各種影響因素，明確各因素的影響程度和相互作用，獲得諸因素各水平的最佳搭配，結合實際生產優選最佳工藝條件。預試驗結果表明，當水提液濃縮至相對密度大約為 1.20（70 ～80 ℃）時，與輔料（糊精、蔗糖粉）混合，利于顆粒的成型，顆粒外觀、均一度、成型率和溶化性等均符合藥典標準，進一步提示該方水提工藝合理、可行。

3.2 指標成分選擇與綜合評分權重比例

丹參為方中君藥，結合預試驗結果，指標成分選擇其水溶性有效成分丹酚酸B。測定方法參照藥典方法，結果丹酚酸B色譜峰分離良好，與其他成分不互相干擾，保留時間適中。曾考察以丹酚酸B和丹參酮為正交試驗的指標成分，建立多指標成分評價方法，綜合優選水提工藝。但由于丹參酮為脂溶性成分，在水提液中含量較低，故最終僅選取丹酚酸B作為正交試驗的指標成分。同時，試驗過程中發現丹酚酸B受熱易分解[8]，因此供試品處理后應及時測定丹酚酸B含量，避免產生誤差。

中藥制劑的提取工藝正交試驗多以干膏率為指標，其方法多數參照2015年版《中國藥典（四部）》通則0831干燥失重測定法。本試驗中正交試驗起初也參照干燥失重測定法測定干膏率，然而難以達到藥典中“恒重”的標準。推測當干膏率較高時，經過較長的加熱時間導致浸膏受熱面積不均勻，部分出現炭化，因此難以確保恒重。因此本試驗參照2015年版《中國藥典（四部）》通則2201浸出物測定法，作為總固形物測定法。

由于丹參為本方君藥，且方中藥味較多，因此綜合評分權重比例中，丹酚酸B含量與總固形物質量各占評分比重的50%。本研究選擇的指標成分是參考2015年版《中國藥典》中藥材飲片的主要成分，其含量不能完全反映制劑的療效，故還需結合藥效和毒理試驗，確定制劑主要療效成分及限定，確定更加科學的提取工藝。

3.3 研究價值

本研究中試驗方法操作簡便，優選出的提取工藝穩定性好，可為將肝纖方進一步開發成中藥制劑提供重要的試驗參考。