UPLC—Q—TOF—MS法分析防風中香豆素類化學成分

任曉蕾 霍金海 孫國東 魏文峰 王偉明

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）03-0349-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.03.14

摘 要 目的：分析防風中香豆素類化學成分，為全面解析防風藥材的藥效物質基礎提供參考。方法：采用超高效液相色譜儀聯用四級桿串聯飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）法。色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，流動相為0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為3 ?L；質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI）在正、負離子模式下進行檢測，離子噴霧電壓ESI+/ESI-為5 500 V/-4 500 V，去簇電壓為80～-80 V，輔助加熱氣壓力為55.00 psi，霧化氣壓力為-55 psi，氣簾氣壓力為-35.00 psi，去溶劑溫度為550 ℃，碰撞活化掃描能量為15 eV；碰撞電壓為35 psi。通過與相關文獻數據及標準品圖譜對照，并結合UPLC-Q-TOF-MS提供的化合物準確相對分子質量進行成分分析及鑒定。結果：在ESI+模式下共解析出了135個化學成分，在ESI-模式下共解析出了105個化學成分。并鑒定出了在ESI+模式下的異歐芹素乙、傘形花內酯、東莨菪素、花椒毒素、補骨脂素、Ostenol、秦皮啶、異歐前胡素、5-羥基-8-甲氧基補骨脂素、珊瑚菜素、紫花前胡素等11個香豆素類化學成分。結論：該方法準確、快速，可用于防風中香豆素類化學成分的分析。

關鍵詞 防風；化學成分；超高效液相色譜儀聯用四級桿串聯飛行時間質譜儀；香豆素

ABSTRACT OBJECTIVE： To analyze chemical components as coumarin in Saposhnikovia divaricata， and to provide reference for comprehensive analysis of pharmacodynamic material base in S. divaricata. METHODS： UPLC-Q-TOF-MS method was adopted. Chromatographic condition： the determination was performed on ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid water-0.1% formic acid acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 35 ℃， and sample size was 3 ?L. MS condition： ESI， in positive and negative ion mode， ESI+/ESI- 5 500 V/-4 500 V， declustering potential of 80--80 V， auxiliary heating gas pressure of 55.00 psi， atomizing gas pressure of -55 psi， curtain gas pressure of -35.00 psi， desolvent temperature of 550 ℃， collision activation scanning energy of 15 eV， collision voltage of 35 psi. Component analysis was performed by comparing with the related literature data and the standard chromatogram control combined with accurate relative molecular mass of compounds provided by UPLC-Q-TOF-MS. RESULTS： Totally 135 chemical components were analyzed in ESI+ mode， and the 105 chemical components were analyzed in ESI- mode. 11 chemical components as coumarin were identified in ESI+ mode， such as isoimperatorin， umbelliferone， scopolamine， xanthotoxin， psoralen， Ostenol， fraxidin， isoimperatorin， 5-hydroxyl-8-methoxypsoralen， phellopterin， decursin. CONCLUSIONS： The method is accurate and rapid， and can be used for the analysis of chemical components as coumarin in S. divaricata.

KEYWORDS Saposhnikovia divaricata； Chemical components； UPLC-Q-TOF-MS； Coumarin

防風為傘形科植物防風[Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.]未抽花莖植株的干燥根[1]，始載于《神農本草經》，列為上品[2]，現主產于黑龍江、內蒙古、遼寧、吉林、河北等省區，其中以黑龍江杜爾伯特（泰康）為中心的草原地區所產的“小蒿子防風”品質最為優良[3]。現代研究表明，防風藥材主要含有色原酮、揮發油、香豆素、多糖及有機酸等多種化學成分，具有抗炎、解熱、鎮痛、抗凝血及抗腫瘤等活性[4-7]。目前，針對防風的化學成分研究多見于早年的植化分離[8-10]，質量評定多見于2015年版《中國藥典》（一部）防風項下2種色原酮成分的含量測定[1，11-14]，不但檢測手段單一，且所建立方法不能全面反映防風藥材的成分。隨著對其藥理作用的深入開展，防風化學成分的快速全面鑒定成為亟待解決的問題。本課題組前期已采用超高效液相色譜儀聯用四級桿串聯飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）法對防風中最主要的化學成分——色原酮類成分進行了詳細解析[6]。香豆素類成分為其另一生物活性主要相關聯的有效成分，具有鎮痛、鎮靜、抗腫瘤等藥理作用[7]，故本研究繼續采用UPLC-Q-TOF-MS法對防風藥材中次主要成分——香豆素類成分進行鑒定，以便進一步闡明防風的藥效物質基礎。

2.4.4 花椒毒素 峰4的tR為5.4 min，ESI+模式下準分子離子峰為m/z=217[M+H]+，脫去一分子甲基形成特征碎片m/z=202[M+H-CH3]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=174[M+H-CO-CH3]+；準分子離子峰分別脫去一分子、兩分子CO形成特征碎片m/z=189[M+H-CO]+、m/z=161[M+H-2CO]+，再脫去一分子甲基形成特征碎片m/z=146[M+H-2CO-CH3]+。根據元素組成分析，該化合物的分子式為C12H8O4，相對分子質量理論值為217.048 9、實測值為217.049 54，誤差為2.95 ppm。據文獻報道[16]，防風中含有花椒毒素，其相對分子質量為217，因此判斷該化合物為花椒毒素，峰4的MS/MS圖見圖5。

2.4.5 補骨脂素 峰5的tR為8.5 min，ESI+模式下準分子離子峰為m/z=187[M+H]+，脫去一分子CO2形成特征碎片m/z=143[M+H-CO2]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=115[M+H-CO2-CO]+；準分子離子峰分別脫去一分子、兩分子、三分子CO形成特征碎片m/z=159[M+H-CO]+、m/z=131[M+H-2CO]+、m/z=103[M+H-3CO]+，再脫去一分子C2H2形成碎片離子m/z=77[M+H-3CO- C2H2]+。根據元素組成分析和相關文獻報道[7]，推斷該化合物分子式為C11H6O3，相對分子質量理論值為187.038 05、實測值為187.038 97，誤差為4.92 ppm。且峰5的裂解規律與補骨脂素對照品相似，可以確定該化合物為補骨脂素，峰5和補骨脂素對照品的MS/MS圖見圖6。

2.4.6 Ostenol 峰6的tR為10.2 min，ESI+模式下準分子離子峰為m/z=231[M+H]+，脫去一分子C3H6形成特征碎片m/z=189[M+H-C3H6]+；準分子離子峰脫去一分子C4H8形成特征碎片m/z=175[M+H-C4H8]+，再分別脫去一分子、兩分子、三分子CO形成特征碎片m/z=147[M+H-C4H8-CO]+、m/z=119[M+H-C4H8-2CO]+、m/z=91[M+H-C4H8-3CO]+。根據元素組成分析，該化合物分子式為C14H14O3；相對分子質量理論值為231.101 21、實測值為231.101 57，誤差為1.56 ppm。據文獻報道[13]，防風中含有Ostenol，其相對分子質量為231，因此判斷該化合物可能為Ostenol，峰6的MS/MS圖見圖7。

2.4.7 秦皮啶 峰7的tR為10.4 min，ESI+模式下準分子離子峰為m/z=223[M+H]+，相繼脫去一分子、兩分子甲基分別形成特征碎片m/z=208[M+H-CH3]+、m/z=193[M+H-2CH3]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=165[M+H-2CH3-CO]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=137[M+H-2CH3-2CO]+。根據元素組成分析，該化合物分子式為C11H10O5；相對分子質量理論值為223.062 66、實測值為223.060 1，誤差為-2.91 ppm。據文獻報道[7，17]，防風中含有秦皮啶，其相對分子質量為223，因此判斷該化合物可能為秦皮啶，峰7的MS/MS圖見圖8。

2.4.8 異歐前胡素 峰8的tR為12.5 min，ESI+模式下準分子離子峰為m/z=271[M+H]+，脫掉兩分子CO獲得 m/z=215[M+H-CO]+離子；準分子離子峰脫去一分子C5H8形成特征碎片m/z=203[M+H-C5H8]+，再脫去一分子H2O形成特征碎片m/z=185[M+H-C5H8-H2O]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=157[M+H-C5H8-H2O-CO]+；準分子離子峰脫去一分子C5H8和一分子CO形成特征碎片m/z=175[M+H-C5H8-CO]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=147[M+H-C5H8-2CO]+。根據元素組成分析，該化合物分子式為C16H14O4；相對分子質量理論值為271.096 61、實測值為271.096 49，誤差為-0.44 ppm。據文獻報道[18]，防風中含有異歐前胡素，其相對分子質量為271，因此推測該化合物可能為異歐前胡素，峰8的 MS/MS圖見圖9。

2.4.9 5-羥基-8-甲氧基補骨脂素 峰9的tR為12.9 min，ESI+模式下準分子離子峰為m/z=233[M+H]+，脫去一分子甲基形成特征碎片m/z=218[M+H-CH3]+，連續再脫掉一分子、兩分子、三分子CO分別形成特征碎片m/z=190[M+H-CH3-CO]+、m/z=162[M+H-CH3-2CO]+、m/z=134[M+H-CH3-3CO]+，再脫去一分子H2O形成碎片m/z=116[M+H-CH3-3CO-H2O]+；準分子離子峰直接脫去一分子甲基和一分子CO2形成特征碎片m/z=174[M+H-CH3- CO2]+；準分子離子峰脫去一分子甲基和四分子CO形成特征碎片m/z=106[M+H-CH3-4CO]+。根據元素組成分析，該化合物分子式為C12H8O5；相對分子質量理論值為233.044 41、實測值為233.044 45，誤差為-0.17 ppm。據文獻報道[5]，防風中含有5-羥基-8-甲氧基補骨脂素，其相對分子質量為233，因此推斷該化合物可能為5-羥基-8-甲氧基補骨脂素，峰9的MS/MS圖見圖10。

2.4.10 珊瑚菜素 峰10的tR為12.9 min，ESI+模式下準分子離子峰為m/z=301[M+H]+，脫掉兩分子CO獲得m/z=245[M+H-2CO]+碎片；準分子離子峰脫去一分子甲基和兩分子CO形成特征碎片m/z=230[M+H-2CO-CH3]+，再脫去一分子CO形成特征碎片m/z=202[M+H-3CO-CH3]+；準分子離子峰脫去一分子C5H8形成特征碎片m/z=233[M+H-C5H8]+，再脫去一分子甲基形成特征碎片m/z=218[M+H-C5H8-CH3]+，再相繼脫去一分子、兩分子、三分子CO形成特征m/z=190[M+H-C5H8-CO- CH3]+、m/z=162[M+H-C5H8-2CO-CH3]+、m/z=134[M+H-C5H8-3CO-CH3]+。根據元素組成分析，該化合物分子式為C17H16O5；相對分子質量理論值為301.107 34、實測值為301.107 05，誤差為-0.96 ppm。據文獻報道[19]，防風中含有珊瑚菜素，其相對分子質量為301，因此推斷該化合物可能為珊瑚菜素，峰10的MS/MS圖見圖11。

2.4.11 紫花前胡素 峰11的tR為13.2min，ESI+模式下準分子離子峰為m/z=329[M+H]+，脫去一分子C5H6O形成特征碎片m/z=247[M+H-C5H6O]+，再脫去一分子水形成碎片離子m/z=229[M+H-C5H6O-H2O]+，再脫去一分子甲基或一分子CO2分別形成m/z=214[M+H-C5H6O- H2O-CH3]+、m/z=185[M+H-C5H6O-H2O-CO2]+的特征碎片。根據元素組成分析，該化合物的分子式為C19H20O5；相對分子質量理論值為329.138 35、實測值為329.138 35，誤差為0。根據文獻報道[20]，防風中含有紫花前胡素，其相對分子質量為329，且在相同MS條件下峰11與紫花前胡素對照品的裂解規律一致，因此判斷該化合物為紫花前胡素，峰11和紫花前胡素對照品的MS/MS圖見圖12。

3 討論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS法對防風藥材香豆素類成分進行了全面分析，該方法具有高分離度、高分辨率、高質量精度和高靈敏度等特點[21]。通過非目標篩選并解析11個成分，理論相對分子質量與實測相對分子質量誤差均小于5 ppm。香豆素是繼色原酮后防風藥材中另一主要藥效物質基礎，其中的異歐芹素乙對小鼠腹腔巨噬細胞體外釋放腫瘤壞死因子具有顯著的抑制作用[22]；傘形花內酯、東莨菪素能明顯抑制組胺及蛋清誘發的大鼠足腫脹，其作用可持續4 h以上，均顯示出較強的抗炎活性[23]；補骨脂素、5-羥基-8-甲氧基補骨脂素對乳腺癌及前列腺癌細胞具有抗腫瘤作用，二者通過抑制線粒體脂質過氧化來保護線粒體功能，均具有良好的抗氧化作用[24]；異歐前胡素具有顯著的鎮痛作用，能明顯抑制熱板所致的小鼠疼痛[25]；紫花前胡素對脂多糖損傷的人急性單核細胞白血病細胞THP-1具有保護作用，能夠降低炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）和單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）的分泌，對相關炎癥疾病具有保護作用[26]。

本研究作為防風藥材質量標志物的前期研究，明確了防風香豆素成分裂解規律，后期本課題組會繼續對防風藥材的體內入血成分進行分析，并結合該結果進一步確定防風藥材的質量標志物，為防風的全面質量評價奠定基礎，并為闡明防風道地性成因打下基礎。

參考文獻

[ 1 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：149.

[ 2 ] 趙博，楊鑫寶，楊秀偉，等.防風化學成分的研究[J].中國中藥雜志，2010，35（12）：1569-1572.

[ 3 ] 趙常英.中藥防風栽培品與野生品藥材性狀顯微組織差異對比[J].中醫臨床研究，2017，9（25）：19-20.

[ 4 ] 黃彧，吳桐，劉春明，等.防風中色原酮類化學成分的分離及鑒定[J].時珍國醫國藥，2018，29（7）：1558-1561.

[ 5 ] 李陽，王旭，李壯壯，等.防風化學成分分離鑒定[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（15）：60-64.

[ 6 ] 劉亞娟，任曉蕾，霍金海，等.防風色原酮類化學成分的UPLC-Q-TOF/MS分析[J].中國中醫藥科技，2018，25（3）：355-361.

[ 7 ] 劉雙利，姜程曦，趙巖，等.防風化學成分及其藥理作用研究進展[J].中草藥，2017，48（10）：2146-2152.

[ 8 ] 楊景明，姜華，王紫瑋，等.防風多糖的提取分離與含量測定方法研究[J].吉林中醫藥，2016，36（5）：513-516.

[ 9 ] 王紫瑋，楊景明，姜華，等.多糖對抽薹防風藥效及其藥動學的影響[J].中成藥，2015，37（11）：2392-2397.

[10] 王鵬軍.兩種不同來源的中藥材：防風的鑒別[J].北方藥學，2016，13（8）：12-13.

[11] 王文祎，徐佳，劉杰，等.不同生長方式防風色原酮物質含量測定及差異性分析[J].世界中醫藥，2015，10（9）：1410-1412，1415.

[12] 項瑞.高效液相色譜法測定防風中色原酮的含量[J].首都醫藥，2014，21（18）：75-77.

[13] 楊景明，姜華，孟祥才.中藥防風質量評價的現狀與思考[J].中藥材，2016，39（7）：1678-1681.

[14] 吳拾保，鄧渝，袁銘銘，等.玉屏風口服液1個異黃酮類及3個色原酮類成分的含量測定[J].藥物分析雜志，2016，36（12）：2221-2225.

[15] 宗亞麗，林玉萍，丁瓊娥，等.竹葉防風地上部分的化學成分研究[J].中藥材，2007，30（1）：42-44.

[16] 劉雙利.防風類藥材的質量評價研究[D].長春：吉林農業大學，2007.

[17] 曾麗君.防風質量標準研究及其資源開發[D].沈陽：沈陽藥科大學，2008.

[18] RYOSUKE M，ALEXANDRE O，LEXANDRE. Molecular evolution of parsnip （Pastinaca sativa） membrane- bound prenyltransferases for linear and/or angular furanocoumarin biosynthesis[J]. NPH，2016，211（1）：332-344.

[19] 姜超.防風中有效成分的提取及對實驗性肝損傷保護作用的研究[D].長春：吉林農業大學，2013.

[20] 閻玉凝，丁書風，郭彥文.防風地區習慣用藥的研究Ⅰ：川防風、竹節防風的生藥與化學成分[J].西北藥學雜志，1988，3（1）：31-34.

[21] 汪丹，蔡甜，吳志軍，等. HPLC-ESI-Q-TOF-MS法分析金錢草顆粒的化學成分[J].中國藥房，2016，27（12）：1651- 1654.

[22] 嵇揚，曾國錢，芮耀誠.歐芹素乙和異歐芹素乙對小鼠腹腔巨噬細胞體外釋放腫瘤壞死因子的抑制作用[J].第二軍醫大學學報，1994，15（6）：511-513.

[23] 李斌，陳鈺妍，李順祥.飛蛾藤屬植物化學成分和藥理作用研究進展[J].科技導報，2013，31（11）：74-79.

[24] 魯亞奇，張曉，王金金，等.補骨脂化學成分及藥理作用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2018，24（20）：132-141.

[25] 王夢月，賈敏如，馬逾英，等.白芷中四種線型呋喃香豆素類成分藥理作用研究[J].天然產物研究與開發，2010，22（3）：485-489.

[26] 李莉，杜紀坤，鄒麗宜，等.朝鮮當歸源紫花前胡素對LPS損傷THP-1細胞的研究[J].廣州化工，2015，43（16）：88- 90.

（收稿日期：2018-07-27 修回日期：2018-11-28）

（編輯：林 靜）