miRNA-494與慢性心力衰竭心肌纖維化相關性的生物信息學分析

梁珊 何亞州 李麗娟

[摘要] 目的 利用生物信息學分析方法，探討miRNA-494與慢性心力衰竭患者心肌纖維化機制的聯系。 方法 利用GEO數據庫篩選出GSE104150數據集，分析慢性心力衰竭患者及健康對照者差異表達miRNA，對其中miR-494預測靶基因及靶基因集分別進行基因本體（GO）富集分析及信號通路富集分析。 結果 與對照者比較，miR-494在慢性心力衰竭患者樣本中呈差異性表達。在細胞質、細胞核等細胞組成，蛋白質結合等分子功能，細胞增殖與遷移、磷脂酰肌醇介導的信號傳導等生物功能，以及多條心肌纖維化、慢性心力衰竭相關信號通路如轉化生長因子-β、PI3K/Akt、MAPK等信號通路中富集。 結論 推測miR-494在慢性心力衰竭患者中差異性表達，并與心肌纖維化發生發展有一定相關性，有待進一步研究證實。

[關鍵詞] miRNA;心肌纖維化;慢性心力衰竭;生物信息學

[中圖分類號] R541.61? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（b）-0007-06

[Abstract] Objective To explore the mechanism of myocardial fibrosis in chronic heart failure patients by using bioinformatics analysis. Methods The GSE104150 dataset through GEO database was filtered out， the differentially expressed miRNAs between heart failure and healthy control was analyzed. The target genes of miR-494 were predicted， which should be performed the gene ontology （GO） enrichment analysis and signal pathway enrichment analysis. Results Compared with the healthy control， miRNA-494 was differentially expressed in the chronic heart failure patients. The GO analysis showed the target genes of miR-494 were enriched in cell components such as cytoplasm and nucleus， molecular functions as protein binding and biological functions as cell proliferation and migration， phosphatidylinositol-mediated signaling. The KEGG biological pathway was mainly enriched in TGFβ， PI3K/Akt， and MAPK signaling pathways. Conclusion It is speculated that miRNA-494 is differentially expressed in patients with chronic heart failure， and it has a certain correlation with the occurrence and development of myocardial fibrosis， further research is needed to confirm.

[Key words] MiRNA; Myocardial fibrosis; Chronic heart failure; Bioinformatics analysis

微小RNA（MicroRNA，miRNA）為非編碼單鏈RNA分子。大量證據表明，其在癌癥、心血管疾病等的發生發展過程中，常存在不同程度的異常表達[1-2]。研究發現，miR-208a與內皮糖蛋白表達及心臟纖維化相關，miRNA-221/222可能靶向與轉化生長因子β（TGFβ）信號傳導相關的幾個基因[3-4]。

心肌纖維化心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）異常增殖并分泌大量膠原蛋白，細胞外基質病理性積聚[5]。心力衰竭是由心肌梗死、心肌病等多種原因引起的心肌損傷，造成心肌結構和功能的變化，導致功能低下。慢性心力衰竭多合并心肌纖維化，心肌纖維化程度與心室射血分數關系密切，心力衰竭的標志性心肌損傷是心肌中間質和微血管周圍內膠原纖維（即Ⅰ型膠原）的彌散積累[6-7]。有效防治心肌纖維化對慢性心力衰竭的發生發展有重大意義。基于此，本研究通過生物信息學分析，為防治慢性心力衰竭心肌纖維化提供新思路。

1 資料與方法

1.1 篩選差異性miRNA

使用Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫檢索miRNA、慢性心力衰竭及心肌纖維化相關基因芯片。

1.2 miRNA靶基因預測及分析

使用TargetScanHuman、miRWalk、miRDB數據庫，對miRNA靶基因進行檢索。利用網頁工具Bioinformatics & Evolutionary Genomics對總靶基因取交集處理。利用DAVID Bioinformatics Resources數據庫工具和KOBAS網頁工具對靶基因集進行功能富集分析及信號通路富集分析。

2 結果

2.1 差異性miRNA

數據庫檢索并篩選出慢性心力衰竭與miRNA相關數據集GSE104150，其中包含人類健康對照及心力衰竭樣本共16個，miRNA共2571個，將P值和logFC設定為：P < 0.01，logFC>2 or <-2，取前20個結果，繪制熱圖（圖1，封四）。其中miRNA-494在慢性心力衰竭樣本中呈高表達，見圖2。經文獻檢索，miR-494在冠心病等心血管疾病中異常表達，并與慢性心力衰竭的發生發展相關。此外，miR-494在纖維化疾病中存在差異性表達，故選擇miRNA-494作為進一步研究對象，探討其在慢性心力衰竭心肌纖維化中的作用及影響。

2.2 miRNA-494靶基因預測

miRNA-494靶基因檢索，TargetScan檢索出2864條結果，miRWalk檢索67 635條結果，miRDB檢索607條結果，對上述數據庫檢索出的靶基因進行取交集，最終得到284個共同的靶基因。靶基因預測交集見圖3。

2.3 miR-494靶基因功能預測

靶基因GO功能富集分析結果顯示這些靶基因富集在蛋白質結合、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區序列特異性DNA結合、轉錄因子活性等分子功能中，在RNA聚合酶Ⅱ啟動子調控轉錄、細胞遷移、磷脂酰肌醇介導的信號傳導等生物過程中富集。并在細胞質、細胞核、高爾基膜、細胞內膜結合細胞器等細胞組成中富集（P < 0.01）。見圖4～6。

2.4 靶基因KEGG通路預測

KOBAS 3.0網頁靶基因集進行KEGG通路檢索，發現miRNA-494靶基因在細胞代謝、腫瘤、鞘磷脂類信號通路、多能干細胞調節通路、TGFβ信號通路、MAPK信號通路信號傳導等有關（P < 0.05）。見圖7。

3 討論

3.1 miRNA-494與慢性心力衰竭、心肌纖維化機制分析

心肌纖維化發生與發展機制涉及各種生長因子如TGFβ、基質金屬蛋白酶（MMP）及其機制因子（TIMP），以及腎素-血管緊張素-醛固酮系統等[8-9]。研究表明MMP2、MMP9在壓力負荷誘發心力衰竭、心肌纖維化過程中具有重要作用。而有研究表明miR-494的上調能抑制MMP9的表達[10]。M？觟hnle等[11]通過實驗及計算分析發現miRNA-494能下調CB1受體，對心肌內源性大麻素系統產生影響，參與在心力衰竭的發展。

研究表明，miR-494與慢性心力衰竭相關的心肌內源性大麻素系統有關，并與心肌纖維化相關的基質金屬蛋白酶系統有靶向關系，此外，結合本次數據分析結果發現miR-494與細胞增殖、分化與遷移相關。KEGG通路預測分析結果中miR-494涉及心肌纖維化的通路包括TGFβ、PI3K-Akt、AMPK、MAPK信號通路，且其中TGFβ、PI3K-Akt信號通路與心力衰竭的發展具有相關性[12-13]。由此可推測，miR-494與慢性心力衰竭心肌纖維化的發生發展相關。

3.2 miRNA-494通路預測分析

3.2.1 TGFβ信號通路? TGFβ信號通路被認為是組織修復和纖維化的公共通路，TGFβ超家族介導細胞的生長、增殖、分化，并在細胞外基質的形成等方面具有重要作用。KEGG通路分析發現，miR-494能靶向通路中的SARA、BMPRⅡ、p15等基因。研究發現，SARA的C端序列包含Smad結合結構域，能夠抑制Smad2/3磷酸化并阻斷Smad2/3和Smad4之間的相互作用，從而抑制纖維化。而p15基因，研究發現組蛋白去乙酰化酶抑制劑在心力衰竭的臨床前模型中阻斷心臟纖維化。研究[14-17]表明Ⅰ類蛋白去乙酰化酶抑制劑能通過抑制編碼細胞周期蛋白依賴性激酶，阻斷心臟成纖維細胞周期進展。此外，TGFβ除了促進心臟纖維化，也能激活反調節途徑，用于調節心力衰竭中的TGF-β1活性[18]。

3.2.2 PI3K/Akt 信號通路? ?PI3K/Akt信號通路中，PI3K可調控Akt的激活，進一步激活或者抑制下游靶蛋白，參與多種細胞活動。KEGG通路分析，在PI3K/Akt通路中，miR-494靶向相關因子包括JAK、PTEN、PTK、PP2A等。Li等[19]敲除小鼠PP2A基因，發現PP2A活性的降低導致小鼠心肌細胞肥大和纖維化增加;而PP2ACα的缺失導致心力衰竭，表現為射血分數、FS、LV、心房利鈉肽、腦利鈉肽的變化;在分子層面上，基因敲除小鼠中Akt/GSK3β/β-連環蛋白途徑的調節受到嚴重干擾。此外，Zhang等[20]的研究發現PP2A能在體外使細胞外調節蛋白激酶去磷酸化，從而阻斷Ang Ⅱ刺激的α-SMA表達，即抑制心肌纖維化的發生。

3.2.3 MAPK信號通路? 其組成因子能被細胞因子、激素等因素激活，調控細胞的生長、分化、應激適應、炎性反應等細胞過程[21]。KEGG通路分析，其涉及包括經典通路的RTK、RSK2以及JNK和p38/MAPK通路的LN1、JNK、JunD等。JNKs是MAPK家族的成員，介導炎癥和細胞凋亡。有學者在研究抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）對長期升主動脈瓣狹窄大鼠心臟結構和功能的影響時發現，NAC能降低p-ERK和p-JNK蛋白表達，調控MAPK信號通路，減輕心肌纖維化，并降低右心室肥大的發生率[22-23]。

綜上所述，此次分析顯示miR-494在慢性心力衰竭患者及健康者之間差異性表達。其靶基因生物學功能預測結果涉及蛋白質結合、轉錄因子活性以及細胞遷移等，信號通路富集分析更與TGFβ信號通路、MAPK信號通路等心肌纖維化相關信號通路密切相關，可推測miR-494在慢性心力衰竭心肌纖維化發生發展過程中具有重要作用。miRNA的調控作用較為復雜，生物信息學方法分析、預測miRNA的靶基因及其功能等信息能夠為后期實驗提供依據，減少耗時及耗材。但由于生物信息分析因為算法不同有一定的局限性，因此在以生物信息學分析結果基礎上仍需實驗驗證。

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（收稿日期：2018-12-10? 本文編輯：任? ?念）