依達拉奉對海水淹溺性大鼠急性肺損傷治療作用的影響

陳卓 山淇 李宏

[摘要] 目的 觀察依達拉奉對海水淹溺性大鼠急性肺損傷的治療作用，并探討其作用機制。 方法 根據隨機數字表法將40只健康雄性SD大鼠分為空白對照組（C組）、依達拉奉組（E組）、海水淹溺組（S組）和治療組（SE組），每組10只。氣管內注入人工海水建立動物模型：C組暴露氣管后尾靜脈注射2 mL/kg生理鹽水;E組暴露氣管后尾靜脈注射2 mL/kg依達拉奉注射液;S組暴露氣管后于氣管內注入4 mL/kg人工海水+尾靜脈注入2 mL/kg生理鹽水;SE組暴露氣管后于氣管內注入4 mL/kg人工海水+尾靜脈注入2 mL/kg依達拉奉注射液。造模6 h后處死大鼠，檢測各組大鼠肺組織濕/干比、支氣管肺泡灌洗液蛋白含量、血清白細胞介素（IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量和肺組織病理改變;RT-PCR及Western blot檢測水通道蛋白（AQP）1和AQP5 mRNA及蛋白表達量。 結果 S組大鼠肺組織濕干比明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠肺組織濕干比低于S組（P < 0.05）。S組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量低于S組（P < 0.05）。S組和SE組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α含量均明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠血清IL-6、TNF-α含量明顯低于S組，血清IL-10含量明顯高于S組（P < 0.05）。S組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達量高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達量低于S組（P < 0.05）。 結論 依達拉奉可通過調節AQP1和AQP5的表達減輕海水淹溺造成的急性肺損傷。

[關鍵詞] 依達拉奉;淹溺;急性肺損傷;水通道蛋白

[中圖分類號] R-332? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（b）-0016-05

[Abstract] Objective To observe the therapeutic effect of Edaravone on acute lung injury in seawater drowning rats and explore its mechanism. Methods Forty healthy male SD rats were divided into control group （group C）， Edaravone group （group E）， seawater drowning group （group S） and treatment group （group SE） according to random number table method， with 10 rats in each group. Artificial seawater was injected into trachea to establish animal models： group C was injected with 2 mL/kg saline via tail vein after tracheal exposure; group E was injected with 2 mL/kg Edaravone injection via tail vein after tracheal exposure; group S was injected with 4 mL/kg artificial seawater after tracheal exposure + 2 mL/kg saline via tail vein; group SE was injected with 4 mL/kg artificial saline via trachea after tracheal exposure + 2 mL/kg Edaravone injection via tail vein. Six hours after the establishment of the model， rats were killed. The wet/dry weight ratio， protein concentration in bronchoalveolar lavage fluid， interleukin （IL）-6， IL-10， serum tumor necrosis factor-α （TNF-α） content and pathological changes of lung tissue were detected. The mRNA and protein expression of aquaporin （AQP）-1 and AQP5 were detected by RT-PCR and Western blot. Results The wet-dry ratio of lung tissue in group S was significantly higher than that in group C （P < 0.05）， and that in group SE was lower than that in group S （P < 0.05）. The protein content of bronchoalveolar lavage fluid in group S was significantly higher than that in group C （P < 0.05）; the protein content of bronchoalveolar lavage fluid in group SE was lower than that in group S （P < 0.05）. The serum levels of IL-6， IL-10 and TNF-α in group S and SE were significantly higher than those in group C （P < 0.05）; the serum levels of IL-6 and TNF-α in group SE were significantly lower than those in group S， and the serum level of IL-10 was significantly higher than that in group S （P < 0.05）. The expression of AQP1 and AQP5 in lung tissue of rats in group S was higher than that in group C （P < 0.05）; the expression of AQP1 and AQP5 in lung tissue of rats in group SE was lower than that in group S （P < 0.05）. Conclusion Edaravone can alleviate the acute lung injury caused by seawater drowning by regulating the expression of AQP1 and AQP5.

[Key words] Edaravone; Drowning; Acute lung injury; Aquaporin

近年來，隨著海洋領域軍事、商業和娛樂活動的逐漸頻繁，全球范圍內因淹溺導致死亡的人數逐年升高，已經成為最常見的意外死亡原因之一[1]。相關研究證實，淹溺后海水吸入肺內，形成淹溺性急性肺損傷（SW-ALI），直至發展成急性呼吸窘迫綜合征，導致死亡[2]。在臨床上，目前尚無有效方法治療SW-ALI，在機械通氣的基礎上，使用有效的藥物抗炎治療，可減輕肺損傷[3-4]。依達拉奉作為一種新型自由基清除劑[5]，在臨床上已經廣泛應用于神經系統疾病的治療，并取得了良好的療效[6-7]。動物實驗發現，依達拉奉可以緩解缺血再灌注和內毒素所引起的急性肺損傷[8-9]。然而，其對SW-ALI治療作用的研究目前仍鮮有報道。本實驗通過構建海水SW-ALI動物模型，觀察依達拉奉對SW-ALI的作用，并初步分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

依達拉奉注射液（福建天泉藥業股份有限公司，生產批號：H20110090，每支15 mg，10 mL），腫瘤壞死因子α（TNF-α，南京建成科技有限公司，生產批號：20180603），白細胞介素-6（IL-6，南京建成科技有限公司，生產批號：20180529），白細胞介素-10（IL-10，南京建成科技有限公司，生產批號：20180605），ELISA試劑盒（南京建成科技有限公司），逆轉錄試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，生產批號：CW2569M），熒光定量試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，生產批號：CW2601M）。人工海水配制：根據國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的東南沿海海水主要成分：氯化鈉26.518 g/L，硫酸鎂3.305 g/L，氯化鎂2.447 g/L，氯化鈣1.141 g/L，氯化鉀0.725 g/L，碳酸氫鈉0.202 g/L，溴化鈉0.083 g/L;滲透壓1300 mmol/L，pH 8.2，相對密度1.05。海水現配現用。

1.2 實驗動物及分組

清潔級健康雄性SD大鼠40只，體質量220～260 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[合格證號：SCXK（京）2016-0006]。本研究經武警部隊特色醫學中心倫理委員會批準。根據隨機數字表法將大鼠分為四組，即：空白對照組（C組）、依達拉奉組（E組）、海水淹溺組（S組）和治療組（SE組），每組10只。氣管內注入4 mL/kg人工海水建立動物模型：C組暴露氣管后尾靜脈注射2 mL/kg生理鹽水;E組暴露氣管后尾靜脈注射2 mL/kg依達拉奉注射液;S組暴露氣管后于氣管內注入4 mL/kg人工海水造模，隨后尾靜脈注入2 mL/kg生理鹽水;SE組暴露氣管后于氣管內注入4 mL/kg人工海水造模，隨后尾靜脈注入2 mL/kg依達拉奉注射液。6 h后處死大鼠，收集組織標本。

1.3 肺組織病理學檢查

每組大鼠取相同部位肺組織，4%多聚甲醛固定24 h后，常規石蠟包埋和切片，進行HE染色并觀察肺組織病理變化。

1.4 肺組織濕干比測定

每組大鼠取相同肺葉，擦拭表面水分及血跡后，立即電子天平稱重，記為濕重，再將肺葉放入70℃烤箱中72 h，至恒定重量，記為干重，并計算濕干比。

1.5 支氣管肺泡灌洗液蛋白含量測定

打開胸腔，結扎右主支氣管，用特制的氣管插管插入左主支氣管，用生理鹽水4 mL緩慢注入左肺中，并輕柔肺部使生理鹽水在肺部均勻分布，重復灌洗3次，回收支氣管肺泡灌洗液，后4℃離心，取上清液用BCA法測蛋白含量。

1.6 血清IL-6、IL-10和TNF-α檢測

采用ELISA檢測血清IL-6、IL-10和TNF-α含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測水通道蛋白（AQP）1、AQP5 mRNA表達量

首先，Trizol法提取肺組織標本RNA，紫外分光光度儀測定RNA純度;然后，將提取的RNA逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴增AQP1和AQP5，以β-actin為內參照。各引物序列均由上海生工生物技術有限公司合成，AQP1基因：上游為5′-TCTGGAGGC-TGTGGTGGCT-3′，下游為5′-AAGTGAGTTCTCGAG-CAGGGA-3′;AQP5基因：上游為5′-TGGGTCTTCTG-GGTAGGGCCTATTGT-3′，下游為5′-GCCGGCTTTGGCACTTGAGATACT-3′;β-actin：上游為5′-ATCTGGCACCACACCTTC-3′，下游為5′-AGCCAGGTCCAG-ACGCA-3′。擴增條件為：95℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，70℃ 45 s，共40個循環，自動4℃保存。采用2-ΔΔct計算相對表達量進行分析。

1.8 Western blot檢測AQP1和AQP5蛋白表達量

取適量肺組織，加入蛋白裂解液勻漿，離心收集上清液，獲得肺組織蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白。將標記的膜放入1%的脫脂奶粉封閉液中，并在室溫緩慢振蕩2 h;一抗按1∶1000稀釋加入，4℃搖床震蕩過夜，TBST洗膜;加入二抗，37℃溫育2 h，再次洗滌;將膜在暗室滴上發光液，避光保存并照相，結果做灰度掃描分析。

1.9 統計學方法

數據采用GraphPad Prism 6.0軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠肺組織病理學檢測結果比較

肺組織大體標本觀察：C組與E組大鼠肺組織表面光滑、完整;S組大鼠肺組織可見水腫明顯，表面可見散在點、片狀出血灶;SE組大鼠肺組織標本可見輕微水腫，表面偶見點狀出血灶。肺組織HE染色后觀察（圖1）：C組與E組大鼠肺組織無明顯病理改變;S組大鼠肺組織出現典型的急性肺損傷病理改變，可見大量中性粒細胞浸潤，間質性水腫，肺泡間隔增厚，斑片狀出血灶;SE組大鼠與S組比較，肺組織間質性水腫程度減輕，出血灶減少，中性粒細胞浸潤減輕。

2.2 四組大鼠肺組織濕干比結果比較

S組大鼠肺組織濕干比明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠肺組織濕干比低于S組（P < 0.05）;C組與E組大鼠肺組織濕干比比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 四組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量比較

S組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量低于S組（P < 0.05）;C組與E組大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖3。

2.4 四組大鼠血清細胞因子含量比較

S組和SE組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α含量均明顯高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠血清IL-6、TNF-α含量明顯低于S組，血清IL-10含量明顯高于S組（P < 0.05）;C組與E組大鼠血清細胞因子含量比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.5 四組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達量比較

S組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達量均高于C組（P < 0.05）;SE組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達量低于S組（P < 0.05）;C組與E組大鼠肺組織AQP1和AQP5 mRNA和蛋白表達量比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖4。

3 討論

近年來隨著開發海洋資源活動的逐漸頻繁，海水淹溺事故也逐漸增多。全世界每年約有37.2萬人因溺水導致死亡[10]。海水是一種高滲、低溫的液體[11]，吸入海水后，高滲透壓和低溫共同作用于肺組織，破壞肺泡結構，引起炎性反應。本實驗結果顯示，SW-ALI模型大鼠肺泡毛細血管膜的通透性增加，肺水腫程度增高，炎性因子聚集，呈現急性肺損傷的病理改變，這是由于高滲透壓的海水可導致肺間質和肺泡毛細血管中液體滲漏至肺泡中，形成肺水腫和低氧血癥[12]。同時肺水腫引起肺泡-毛細血管膜的通透性增高，進一步導致周圍液體滲漏至肺泡中，加重支氣管和肺泡結構的破壞，同時大量炎性介質釋放并進一步損害肺組織[13]。依達拉奉由于具有抗氧化和抗自由基的作用，現被廣泛應用于急性腦卒中和腦水腫的治療[14-16]。若將其用于SW-ALI的治療，能否發揮同樣的效果，有待探討。本實驗在應用依達拉奉后，可見一方面通過下調血清促炎因子TNF-α、IL-6及上調血清抑炎因子IL-10的表達，改善海水淹溺后肺部炎性反應;另一方面通過降低肺泡毛細血管通透性，抑制肺水腫的形成，除了已知的抗氧化作用外，是否還影響了其他通路相關蛋白的表達從而發揮治療作用，有待進一步研究，為此本實驗檢測了肺組織AQP的表達。

AQP是一組廣泛分布于生物細胞膜上具有調節水分子轉運功能的內在蛋白[17]。在人類細胞中發現的AQP至少有12種，在肺組織中主要有6種AQP表達，包括AQP1、AQP3、AQP5、AQP8、AQP9。有研究證實，AQP1和AQP5與肺組織內水分跨膜轉運有著密切的關系[18]。因此，推測依達拉奉改善肺水腫的機制可能與調節AQP1和AQP5的表達有關。本研究結果表明，海水淹溺后可促進AQP1和AQP5的表達，而依達拉奉可抑制AQP1和AQP5的表達。有研究表明，急性高原缺氧引起的肺水腫和海水淹溺引起的肺損傷中AQP1和AQP5的表達上調[19]。She等[20]發現通過敲除小鼠AQP5基因可增加高原型肺水腫損傷程度，提示AQP可能參與了急性肺損傷肺水腫形成的病理過程，這對研究肺水腫的發生機制提供了新的思路。

綜上所述，本研究通過構建SW-ALI模型，探討依達拉奉對SW-ALI的治療效果，并基于AQP進一步探索其治療機制，發現依達拉奉在改善肺部炎癥的同時，可能通過降低AQP1和AQP5水平，調節肺內水分的分布，緩解肺水腫，最終實現對SW-ALI的治療作用，為臨床上治療SW-ALI提供了新的思路。

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（收稿日期：2019-01-22? 本文編輯：李亞聰）