采用UPLC-Q-TOF-MS技術鑒定連翹中45種化學成分

周明月 霍金海 孫國東 王偉明

中圖分類號 R282;R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）22-3067-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.09

摘 要 目的：對連翹藥材的化學成分進行結構鑒定。方法：利用超高效液相色譜聯用四極桿串聯飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術對連翹的化學成分進行分析。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為5 μL;采用電噴霧正、負離子模式檢測，離子源溫度為550 ℃，霧化氣體為N2，霧化氣、輔助氣壓力均為379.2 kPa，氣簾氣壓力為241.3 kPa，去簇電壓為80 V/-80 V，碰撞能量為35 eV/-35 eV，質量掃描范圍為80～1 500 Da。利用Peakview 2.0軟件通過所測得成分的一級質譜進行目標性篩查，并計算各成分的高分辨精確分子量，對比對照品圖譜以及相關文獻，或計算二級質譜中碎片離子的元素組成及分析其裂解途徑，推斷化合物結構。結果與結論：共鑒定出連翹中的45個化合物，包括7個苯乙醇苷類成分、5個木脂素類成分、5個萜類成分、12個黃酮類成分、7個有機酸類成分、2個酚類成分、2個醌類成分、2個苷類成分和3個其他成分;其中有19個化合物為首次在連翹中得以鑒定。本研究可為連翹藥效物質基礎的深入研究及其成分的快速定性、定量分析提供基礎。

關鍵詞 連翹;化學成分;鑒定;超高效液相色譜;四極桿串聯飛行時間質譜;苯乙醇苷類;木脂素類

Identification of 45 Kinds of Chemical Components of Forsythia suspensa by UPLC-Q-TOF-MS

ZHOU Mingyue，HUO Jinhai，SUN Guodong，WANG Weiming（Institute of Chinese Materia Medica， Heilongjiang Academy of TCM， Harbin 150036， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To identify chemical components of Forsythia suspense. METHODS： UPLC-Q-TOF-MS technology was used for the chemical components analysis of F. suspense. The determination was performed on ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid aqueous solution （A）- 0.1% formic acid acetonitrile solution （B） with ?gradient elution， at the flow rate of 0.3 mL/min; the column temperature was set at 30 ℃; the sample size was 5 μL. Positive and negative ions were detected by electrospray ionization. The temperature of the ion source was 550 ℃; the atomizing gas was N2; the atomizing gas and the auxiliary pressure were 379.2 kPa; the air curtain pressure was 241.3 kPa; the decluster voltage was 80 V/-80 V; the collision energy was 35 eV/-35 eV; the mass scanning range was 80-1 500 Da. Peakview 2.0 software was used to screen the target components by the first-order mass spectrometry， and calculate the high-resolution and accurate molecular weight of each component， compare with the reference spectrum and related literature， or calculate the elemental composition of fragment ions in the second-order mass spectrometry， analyze their decomposition pathways， then infer the structure of compounds. RESULTS & CONCLUSIONS： 45 kinds of compounds were identified from F. suspense，which included 7 phenylethanol glycosides，5 lignans，5 terpenes， 12 flavonoids，7 organic acids，2 phenols，2 quinones，2 glycosides and 3 other components. There were 19 compounds identified for the first time in F. suspense. The study provides a reference for the in-depth study of the pharmacodynamic substance basis of F. suspense and the rapid qualitative and quantitative analysis of the components.

KEYWORDS ? Forsythia suspense; Chemical components; Identification; UPLC; Q-TOF-MS; Phenylethanol glycosides; Lignins

連翹為木犀科連翹屬植物連翹[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]的干燥果實，氣微香，味苦，性微寒，歸肺、心、小腸經，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱等功效，有“瘡家圣藥”之稱。連翹在臨床上常用于治療癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風熱感冒、溫病初起、溫熱入營、高熱煩渴等癥[1]。現代藥理研究顯示，連翹具有抗炎、抗病毒、解熱鎮痛、止嘔、保肝等作用，具有重要的開發價值[2]。然而，目前研究者對連翹化學成分的研究多集中于單個成分的提取分離與結構鑒定[3-5]，檢測手段單一，在線分離與系統分析的報道較少，且所建立方法不能全面反映連翹藥材的組成，這限制了對其藥效物質基礎的全面認識及多成分的快速定性定量分析，不利于該藥材資源的深入開發與利用。隨著對連翹藥理作用研究的深入，其化學成分的全面快速鑒定成為亟待解決的問題。

液質聯用（LC-MS）技術是當代最重要的分離鑒定分析方法之一，兼具LC技術高分離效能和MS技術高靈敏度、高選擇性為一體的優點。中藥材及中藥復方中化學成分種類繁多、結構復雜，LC-MS已成為快速分析鑒定其化學成分最常用的有力工具[6-10]。近年來，超高效液相色譜聯用四極桿串聯飛行時間質譜（UPLC- Q-TOF-MS）技術已廣泛用于中藥成分的在線分析與藥效物質的基礎研究中[11-13]。本課題組前期采用UPLC-Q-TOF-MS技術對連翹中最主要的化學成分——苯乙醇苷類成分（具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，被認為是連翹中的主要活性成分[14]）進行了詳細解析。基于此，本研究將采用此技術進一步對連翹中的化學成分進行鑒定，以便闡明其藥效物質基礎。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC型UPLC儀（美國Waters公司）;AB Sciex Triple-TOFTM 5600型MS儀（美國Sciex公司）;KQ-300DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;BSA224S-CW型電子天平、BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號分別為L-012-171216、L010- 170301、L-007-160504，純度均≥98%）;蘆丁對照品（國家食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707，純度：≥98%）;甲醇（分析純，西隴科學股份有限公司）;乙腈（色譜純，德國Merck公司）;甲酸（色譜純，美國Fisher公司）;蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 藥材

連翹藥材（青翹，采收時間為2018年6月，批號：180601）購于北京同仁堂（亳州）飲片有限責任公司，經黑龍江省中醫藥科學院霍金海副研究員鑒定為木犀科連翹屬植物連翹[F. suspensa（Thunb.）Vahl]的果實。藥材粉碎后過三號篩，備用。

2 方法

2.1 LC條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，5%B→25%B;3～13 min，25%B→80%B;13～23 min，80%B→100%B;23～23.1 min，100%B→5%B;23.1～25 min，5%B）;流速：0.3 mL/min;柱溫：30 ℃;進樣量：5 μL。

2.2 MS條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）;離子化模式：電噴霧正、負離子模式;離子噴霧電壓（ESI+/ESI-）：5 500 V/-4 500 V;離子源溫度：550 ℃，去簇電壓：80 V/-80 V;碰撞能量：35 eV/-35 eV，碰撞活化掃描能量：15 eV;霧化氣體：N2;霧化氣、輔助氣壓力：379.2 kPa;氣簾氣壓力：241.3 kPa;質量掃描范圍：80～1 500 Da。對響應值超過100 cps的8個最高峰進行二級質譜掃描，子離子質量掃描范圍為50～1 500 Da，開啟動態背景扣除（DBS）。采用Analyst TF 1.6軟件進行數據采集，采用PeakView 2.0軟件進行數據處理。

2.3 供試品溶液的制備

取連翹細粉約1.0 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率：300 W，頻率：100 kHz）處理30 min;放冷后，再次稱定質量，用甲醇補足減失質量，搖勻;溶液以0.22 ?m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 對照品溶液的制備

取連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸、蘆丁對照品適量，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，分別制成質量濃度均為20 μg/mL的對照品溶液，即得。

2.5 UPLC-MS分析

取“2.3”“2.4”項下對照品溶液和供試品溶液，按“2.1” “2.2”項下LC與MS條件進樣測定，記錄色譜圖，用于后續成分篩查與結構鑒定。

2.6 連翹化學成分解析

2.6.1 成分篩查 通過查閱國內外文獻，將連翹屬化學成分信息進行匯總，包括中文或英文名稱、分子式、結構式、相對分子質量、成分類型、化學物質登錄號（CAS號）、所屬植物藥用部位、結構鑒定信息（包括質譜、氫譜、碳譜等），建立一個包含連翹屬157種化合物的一級質譜數據庫。選擇Peakview 2.0軟件中的“MasterView”工具，設置“Mass Error”值<5×10-6（權重為30%）、“Isotope”差異值<10%（權重為40%）、“Formula Finder Score”值>70%（權重為40%），通過所測得的成分的一級質譜進行目標性篩查。

2.6.2 結構鑒定 利用Peakview 2.0軟件中的“Formula Findera”工具計算各成分的高分辨精確分子質量，快速推測各色譜峰對應化合物的分子式，并與已有對照品的保留時間及二級質譜數據對比，推斷成分結構;對于一些無法獲得對照品的化合物，先依據二級質譜的碎片離子信息計算出其元素組成，再推測其裂解方式，進一步推斷出化合物結構。

3 結果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS分析結果

在正、負離子模式下，供試品溶液分離效果及離子化效率良好，總離子流圖見圖1（對照品圖譜略）。

3.2 化合物結構鑒定結果

經與對照品圖譜及相關文獻數據對照，并結合UPLC-MS所測得化合物的高分辨相對分子量結果進行成分分析，共鑒定出連翹藥材中的45個化合物，包括7個苯乙醇苷類成分、5個木脂素類成分、5個萜類成分、12個黃酮類成分、7個有機酸類成分、2個酚類成分、2個醌類成分、2個苷類成分和3個其他成分，詳見表1。

3.3 化合物質譜裂解特征分析

本研究共鑒定出45種化合物，主要包括木脂素類、黃酮類、萜類、有機酸類等。選擇每一類化合物的代表性化合物，同時考慮到連翹酯苷A和連翹苷為2015版《中國藥典》（一部）中連翹項下含量測定的主要特征性成分，故對連翹酯苷A、連翹苷、松脂醇、金絲桃苷、漢黃芩苷、阿魏酸和奎寧酸等7種化合物進行裂解特征分析。

3.3.1 連翹酯苷A 根據文獻報道，苯乙醇苷類化合物在連翹中的含量很高，其中主要為連翹酯苷A[6]。35號化合物在ESI-模式下的準分子離子為m/z 623[M-H]-，先脫去1分子鼠李糖，形成碎片離子m/z 461[M-H-C6H10O5]-;然后再脫去1分子H2O，形成碎片離子m/z 443[M-H-C6H10O5-H2O]-;再脫去C13H12O6，形成碎片離子m/z 179[M-H-C6H10O5-H2O-C13H12O6]-;最后再脫去1分子H2O，形成碎片離子m/z 161[M-H-C6H10O5-2H2O-C13H12O6]-。根據35號化合物的裂解碎片特征判斷該化合物為連翹酯苷A，其二級質譜圖見圖2，裂解途徑見圖3。

3.3.2 連翹苷 根據文獻報道，連翹苷為連翹的主要活性成分[15]。44號化合物在ESI+模式下的準分子離子為m/z 557[M+Na]+，先脫去1分子葡萄糖并發生氫重排而形成碎片離子m/z 395[M+Na-C6H10O5]+;或者脫去C6H10O6得到碎片離子m/z 379[M+Na-C6H10O6]+;或者脫去2個五元環及所連接的甲氧基苯環得到碎片離子m/z 309[M+Na-C14H16O4]+，后脫去苯環形成碎片m/z 185[M+Na-C14H16O4-C7H8O2]+。根據44號化合物的裂解碎片特征判斷該化合物為連翹苷，其二級質譜圖見圖4，裂解途徑見圖5。

3.3.3 松脂醇 18號化合物在ESI+模式下的準分子離子為m/z 359[M+H]+，脫去1分子水形成碎片離子m/z 341[M+H-H2O]+，再脫去OCH2形成碎片離子m/z 311[M+H-H2O-OCH2]+，再脫去1個苯環形成碎片離子m/z 205[M+H-H2O-2OCH2-C6H4]+，再脫去C5H8O形成碎片離子m/z 151[M+H-H2O-OCH2-C6H4-C5H8O]+，再脫去C5H6O2形成碎片離子m/z 137[M+H-H2O-OCH2-C6H4-C5H6O2]+，最后脫去1分子甲基形成碎片離子m/z 122[M+H-H2O-OCH2-C6H4-C5H6O2-CH3]+。該化合物為首次從連翹中鑒定出，根據其裂解碎片特征判斷該化合物為松脂醇，其二級質譜圖見圖6，裂解途徑見圖7。

3.3.4 金絲桃苷 連翹含有大量的黃酮類成分，主要包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮等結構母核，據文獻報道，連翹中含有金絲桃苷[16]。36號化合物在ESI-模式下的準分子離子為m/z 463[M-H]-，糖鏈均裂脫去1分子半乳糖形成碎片離子m/z 300[M-H-C6H11O5]-;糖鏈異裂脫去1分子半乳糖形成碎片離子m/z 301[M-H-C6H10O5]-;基峰離子m/z 300失去1分子CO和1個H形成碎片離子m/z 271[M-H-C6H11O5-CO-H]-;碎片離子m/z 301失去1分子CO和1分子H2O形成碎片離子m/z 255[M-H-C6H10O5-CO-H2O]-。根據36號化合物的裂解碎片特征判斷該化合物為金絲桃苷，其二級質譜圖見圖8，裂解途徑見圖9。

3.3.5 漢黃芩苷 43號化合物在ESI+模式下的準分子離子為m/z 483[M+Na]+，脫去C6H8O4形成碎片離子m/z 339[M+Na-C6H8O4]+;或者脫去1分子葡萄糖形成碎片離子m/z 321[M+Na-C6H10O5]+。該化合物為首次從連翹中鑒定出，根據其化合物的裂解碎片特征判斷該化合物為槲皮苷，其二級質譜圖見圖10。

3.3.6 阿魏酸 據文獻報道，連翹中含有有機酸類成分，如阿魏酸[17]。37號化合物在ESI-模式下的準分子離子為m/z 193[M-H]-，脫去CH3形成碎片離子m/z 178[M-H-CH3]-，再脫去1分子CO2形成碎片離子m/z 134[M-H-CH2-CO2]-;脫去1分子COOH形成碎片離子m/z 133[M-H-CH3-COOH]-。碎片離子m/z 134脫去CH形成碎片離子m/z 121[M-H-CH2-CO2-CH]-，再脫去CH3形成碎片離子m/z 106[M-H-CH2-CO2-CH-CH3]-。根據37號化合物的裂解碎片特征判斷該化合物為阿魏酸，其二級質譜圖見圖11。

3.3.7 奎寧酸 26號化合物在ESI-模式下的準分子離子為m/z 191[M-H]-，脫去CH4O3形成碎片離子m/z 127[M-H-CH4O3]-，再脫去1分子水形成碎片離子m/z 109[M-H-CH4O3-H2O]-。該化合物為首次從連翹中鑒定出，根據其化合物的裂解碎片特征判斷其為奎寧酸，其二級質譜圖見圖12。

4 討論

本研究采用的UPLC-Q-TOF-MS技術能夠在較短時間內完成復雜成分的分析工作，為連翹的化學成分鑒定提供了一種高效的分析方法[18-20]。中藥材成分復雜，且不同成分之間的含量相差懸殊，UPLC系統采用粒徑小于2 ?m的柱填料用于成分分離，與傳統高效液相色譜（HPLC）系統普遍采用的5 ?m柱填料相比，前者理論板數更高，可獲得更好的分離效果。由于連翹中含有大量的黃酮類化合物，因此本課題組在流動相中加入0.1%甲酸，以提高黃酮類化合物檢測的靈敏度。質譜條件選擇的離子噴霧（ESI+/ESI-）電壓為5 500 V/-4 500 V，在這個電壓條件下，所有離子都能獲得較高的電離效率。去簇電壓選擇80 V/-80 V，在這個電壓條件下，可以有效消除溶劑的離子簇，也可防止母離子發生源內裂解。

以往研究多針對連翹的苯乙醇苷類化合物進行分析。本研究從連翹中鑒定出的45個化合物大多為木質素類、萜類、醌類和黃酮類化合物，可為連翹中其他類成分的深入研究提供基礎。

綜上所述，本研究利用MS的高分辨率、高靈敏度等特點[21]，對連翹藥材的化學成分進行了分析，共鑒定出45個化合物，主要為苯乙醇苷類、木脂素類及黃酮類化合物，其中有19個化合物為首次在連翹中得以鑒定;同時，明確了連翹中苯乙醇苷類化學成分的MS裂解規律，可為連翹屬藥用植物類似化學成分的MS裂解途徑研究提供參考。這些化合物的結構通過高分辨MS得到了初步的確定，可為連翹體內物質基礎分析，尤其是微量成分的體內代謝研究提供方法學借鑒。

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（收稿日期：2019-05-10 修回日期：2019-09-28）

（編輯：段思怡）