柴胡利膽顆粒中總黃酮含量測定及不確定度評定*

陳舒茵，梁國成，黃小鷗，馮文勇，周光宇

廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院(南寧530011)

試驗樣品在制備、測量過程中，通常會因操作或者測量用具等原因而不可避免的產(chǎn)生誤差，因此多數(shù)測量值只能反映出真實值的近似值。不確定度是合理的表征賦予被測量值的分散性與測量結果相關聯(lián)的參數(shù)[1-2]，是一種科學、合理的質(zhì)量控制方法和驗證手段[3]，能夠較為準確的評估測量結果。

紫外-可見分光光度法(UV-VIS)因其操作簡單、適用性廣等特點，已廣泛應用于藥品分析領域。本文建立了UV-VIS測定柴胡利膽顆粒中總黃酮含量的方法，并根據(jù)歐洲化學委員會頒布的Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement要求[4]，對測定方法進行不確定度評定，探討該法試驗過程中的不確定因素，提高試驗數(shù)據(jù)和檢測結果的準確性和可靠性。

儀器與試藥

1 儀 器 AE240分析天平(梅特勒-托利多公司)，DK-S26電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)，UV-2550紫外分光光度計(日本島津公司)，玻璃器皿為天玻牌A級。

2 試劑與試藥 柴胡利膽顆粒(自制，批號180320，180326，180409)，黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110715-200514，含量測定用)，乙醇(上海沃凱生物技術有限公司，分析純)，無水乙醇(廣東翁江化學試劑有限公司，分析純)，純化水(自制)。

方法與結果

1 溶液的制備

1.1 對照品溶液的制備:精密稱取黃芩苷對照品10.47 mg，以無水乙醇定容于50 ml容量瓶中，再精密量取5 ml至10 ml容量瓶中，加無水乙醇至刻度線，搖勻，即得。

1.2 供試品溶液的制備：取本品18.7315g，精密加入70%乙醇50 ml，熱回流提取3次，每次1 h，收集提取液，過濾，合并，蒸干，用無水乙醇溶解，定容于50 ml容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度線，搖勻后精密移取5～50 ml容量瓶中，加無水乙醇至刻度線，搖勻，即得。

1.3 陰性樣品溶液的制備：取用黃芩陰性樣品18.8734g，照“1.2 供試品溶液的制備”法，制備陰性樣品溶液，備用。

2 檢測波長選擇 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，在200～400 nm范圍進行紫外全波長掃描，結果顯示，黃芩苷對照品溶液與供試品溶液光譜圖基本一致，且陰性無干擾，最終選擇檢測波長為278 nm(圖1～3)。

3 線性及線性范圍的考察 精密吸取對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 ml，分別置于10ml容量瓶中，加無水乙醇稀釋到刻度，搖勻，分別取上述溶液，采用UV-Vis進行測定，以吸光度A(Y)為縱坐標，黃芩苷濃度(mg/ml)(X)為橫坐標繪制標準曲線。

4 方法學驗證

4.1 精密度和重復性試驗：精密吸取“1.2”項下供試品，在278 nm波長下，連續(xù)測定5次，其吸光度的RSD%=0.64%，表明精密度良好。

4.2 穩(wěn)定性試驗：精密吸取“1.2”項下供試品，在278 nm波長下，分別于0、1、3、6、9、12 h測定，測定6次，其吸光度的RSD%=0.77%，表明溶液在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

4.3 重現(xiàn)性試驗：取同一批次的柴胡利膽顆粒5份，分別按“1.2”項下平行制備供試品溶液，依法進行測定，結果RSD%=1.26%，表明樣品重現(xiàn)性良好。

4.4 回收率試驗：精密稱取已知含量的供試品5份，分別精密加入黃芩苷對照品，照“1.2”項下制備供試品溶液，依法測定其中總黃酮含量，計算加樣回收率，見表1。

圖1 黃芩苷UV光譜圖

圖2 供試品溶液UV光譜圖

圖3 陰性UV光譜圖

序號樣品含量(mg)對照品加入量(mg)實測含量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10.26660.11020.372796.2720.25450.11060.363097.2030.25140.11690.361293.9297.002.1040.25270.11830.369999.0750.24970.11530.363398.52

5 樣品含量測定 取不同3個批次的柴胡利膽顆粒，分別按“1.2”項下平行制備供試品溶液，并依法進行測定，見表2。

表2 樣品含量測定結果(mg/g)

6 不確定度的評定

6.1 不確定度的來源：本實驗中，不確定度的主要來源有：對照品溶液制備過程所引入的不確定度、供試品溶液制備過程所引入的不確定度、標準曲線擬合所引入的不確定度、樣品重復測定所引入的不確定度、以及回收率測定所引入的不確定度[5-7]。

6.2 量化不確定度分量

6.2.1 對照品溶液制備引入的不確定度：對照品制備過程中使用十萬分之一天平精密稱取10.47 mg，以無水乙醇定容于50 ml容量瓶(A級)中，再以5 ml單標移液管(A級)精密量取5～10 ml容量瓶中，無水乙醇定容至刻度。故對照品溶液制備引入的不確定度U1有：①對照品稱量的不確定度M1，電子天平經(jīng)檢定為1級，允許誤差±0.100 mg；②溶液配制的不確定度V1，溶液配制過程用到50 ml、10 ml、5 ml單標移液管(A級)據(jù)國家計量檢定規(guī)程JJG196-2006要求[8]，允許誤差分別為±0.050 ml、±0.020 ml、±0.025 ml；其分量評定結果見表3。

由表6可得對照品溶液制備的不確定度：

表3 對照品溶液的不確定度評定

6.2.2 供試品溶液制備引入的不確定度:用十萬分之一天平精密稱取本品18.7315 g，以50 ml單標移液管(A級)精密加入70%乙醇50 ml，熱回流提取3次，每次1 h，收集提取液，過濾，合并，蒸干，用無水乙醇溶解，定容于50 ml容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度線，搖勻后以5 ml單標移液管(A級)精密移取5 ml至50 ml容量瓶中，加無水乙醇至刻度。供試品溶液制備引入的不確定度U2有：①供試品稱量的不確定度M2，電子天平經(jīng)檢定為1級，允許誤差±0.100 mg；②溶液配制的不確定度V2，溶液配制過程用到50 ml、5 ml允許誤差分別為±0.050 ml、±0.025 ml；其分量評定結果見表4。

供試品溶液制備的不確定度：

6.2.3 標準曲線擬合引入的不確定度：本試驗配制了5個濃度的標準溶液Ci：0.01047、0.02094、0.04188、0.06282、0.08376mg/ml，平均濃度C0=0.04397mg/ml，在278nm處測得平均吸光度Ai分別為：0.141、0.218、0.364、0.532、0.696，每個平行測定2次，用最小二乘法擬合，得到直線方程A=bX+a(b為斜率，a為截距)和相關系數(shù)r，見表5。

表4 供試品溶液的不確定度評定

表5 線性最小二乘法擬合

得到b=7.5675，a=0.0574，r=0.9993，線性回歸方程A=7.5675X+0.0574

取一份供試品，平行測定2次，由此得平均濃度C0=0.0472mg/ml。則C0的標準不確定度U(C0)為：

公式中：

p-每份樣品測定的次數(shù)，p=2；

n-標準曲線制備過程中測定了5個濃度，每個濃度測定2次，n=10；

U3=U(C0)/C0=0.0023/0.0472=0.0487

6.3 計算合成標準不確定度：各相對不確定度分量值及貢獻率見表6。

表6 UV-VIS測定柴胡利膽顆粒中總黃酮不確定度分量評定表

7 擴展不確定度和報告不確定度 95%置信區(qū)間下，包含因子k=2，則相對擴展不確定度U95=k×U×100%=2×0.1378×100%=27.56%

由試驗測定柴胡利膽顆粒中總黃酮含量

W=2.26mg/g，故擴展不確定度為：

U95(W)=1.26×0.2756=0.3473mg/g

本次試驗測定得到柴胡利膽顆粒中總黃酮含量為：

W=(1.26±0.3473)mg/g

討 論

不確定度[9]的評定，與方法學驗證一樣，將成為分析領域的重點和難點， 2020年版藥典擬增加《藥品檢測結果的不確定度評定指導原則》的征求意見稿[10]，可見不確定度評定越來越受重視。

評估不確定時，應盡可能考慮到可能產(chǎn)生不確定度的所有因素，各不確定度分量對合成不確定度的貢獻率各異，由表6可看出，UV-VIS測定柴胡利膽顆粒中總黃酮不確定度分量，不確定度主要由對照品溶液配制、供試品溶液配制以及回收率試驗所引入，主要原因在于操作步驟繁多或操作不熟練、以及計量器具等因素，因此試驗過程中應盡可能減少操作步驟，提高操作熟練度，盡量避免使用小容量計量器具進行量取、定容等，以減少因主觀和客觀因素而引入的不確定度，提高測量結果的可靠性。

本文通過UV-VIS試驗的方法學驗證和不確定度的評定，可較為真實的反映試驗過程中各因素所引入的不確定度，評定出測量結果的合成標準不確定度以及擴展不確定度，驗證測定方法的科學性、合理性，也

為同類分析方法的參考提供了可靠依據(jù)。