多粘類芽孢桿菌ARTP誘變及高產菌株的選育

閔勇 王穎 劉曉艷 陳偉 劉芳 楊自文 王開梅 周榮華?

摘? ?要：多粘類芽孢桿菌NBF188對番茄青枯病菌的病原菌茄科勞爾氏菌具有顯著抑菌效果。采用常溫常壓等離子體誘變（ARTP）的方法處理該菌株，篩選得到高產菌株NBF188-R。NBF188-R抑菌效果較出發菌株有顯著的提高，HPLC-MS檢測顯示其多粘菌素的產量提高了106.2%。

關鍵詞：多粘類芽孢桿菌;番茄青枯病菌;常溫常壓等離子體誘變;多粘菌素

文章編號： 1005-2690（2019）13-0040-02? ? ? ?中圖分類號： TQ925.4? ? ? ?文獻標志碼： B

多粘類芽孢桿菌能產生多肽類抗生素，統稱為多粘菌素，于1947年被發現[1-2]。多粘菌素以非核糖體肽形式合成，能與存在于細胞膜上的脂多糖作用，破壞細胞膜磷脂雙分子層的結構，因此對革蘭氏陰性細菌具有較強的抑制作用[3]，且多粘類芽孢桿菌對植物具有非致病性，細胞壁不含內毒素，在產品開發中活菌數量高、性能穩定，是一種理想的生防菌，同時具有促進作物根系生長的作用，目前在農業和醫學上均有廣泛的應用[4-5]，在農業生產上，多粘類芽孢桿菌主要用于茄果類蔬菜青枯病的防治。茄果類青枯病是一種毀滅性的土傳性病害，俗稱植物“癌癥”，是由茄科勞爾氏菌引發的一種生理性病害。

菌種選育是一種將菌株經過物理或化學誘變處理后，篩選得到產量提高的正突變菌株的技術。其中紫外線照射處理和化學物質處理是常用的誘變手段。常壓室溫等離子體（ARTP）作為一種方便快捷的誘變手段，在菌種選育中被廣泛地應用，已有許多試驗證明該方法能夠高效地篩選得到正突變菌株[6-7]，不過由于一些突變體不穩定，后期選擇合適的篩選方法和遺傳穩定性驗證很關鍵。

試驗選用一株能有效抑制茄科勞爾氏菌生長的多粘類芽孢桿菌NBF188，采用常壓室溫等離子體誘變（ARTP）的方法進行誘變育種，同時通過高通量篩選獲得高產菌株，為其在田間應用提供理論基礎。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

1.1.1? ?番茄青枯病原菌菌株

試驗所涉及的番茄青枯病病原菌分離自發病的番茄植株。發病的番茄植株取自湖北省農業科學院經濟作物研究所蔬菜實驗基地。

1.1.2? ?生防菌來源

多粘類芽孢桿菌NBF188，由湖北省生物農藥工程研究中心保藏。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ?平板抑菌測定篩選生防菌

將番茄青枯病病原菌及多粘類芽孢桿菌NBF188分別接種于SPA和LB液體培養基，置于30℃振蕩培養過夜，將培養好的菌液調整OD600至1.0后備用。吸取0.1mL番茄青枯病病原菌作為指示菌，加入200mL融化好的NA培養基中，混勻后倒平板。將圓形濾紙片平鋪于培養基表面，吸取5μL的NBF188菌液滴在濾紙片上，30℃培養箱中培養48h，每個樣品設置3個重復。待能觀察出明顯的抑菌圈時，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算平均值。

1.2.2? ?生防菌的ARTP等離子體誘變及篩選

參照ARTP標準誘變流程處理篩選出來的生防菌。將菌株搖瓶培養至對數期，此時OD600值為0.5，取10μL菌液均勻涂抹于金屬載片，將載片移至ARTP誘變育種儀操作室，照射間距約為2mm。設置儀器誘變功率為100W，氣流量為10SLM。設置不同的處理時間分別為20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s，制作致死率曲線確定最佳的誘變條件。致死率=（未經誘變處理菌落數-經誘變處理菌落數）/未經誘變菌落數×100%。選擇最優輻照時間，將誘變菌液梯度稀釋后涂布于LB平板，確定最佳誘變和生長條件。

挑取至少500個生長出來的單菌落接種于LB液體培養基，搖床上振蕩培養24h。將培養出來的菌液進行平板抑菌效果測定，根據抑菌圈大小初步判斷高產菌株。將初篩出的菌株接入LB液體培養基中搖瓶培養48h，并采用HPLC-MS液質聯用的檢測方法準確的測定菌液中多粘菌素的產量，從而篩選出5株高產量的誘變菌株。最后對這些5株誘變菌株分別傳代3次驗證其遺傳穩定性。

2? ?結果與分析

2.1? ?生防菌NBF188的ARTP等離子體誘變

根據致死率公式，以誘變時間為橫坐標，制作致死率曲線。從圖1中可以看出，等離子體照射處理生防菌NBF188的時間與其致死率存在明顯相關性。照射時間50s時致死率為91.9%，照射超過60s后致死率為99%左右。經過測定，致死率在90%左右NBF188有較高的正突變率，所以50s為合適的生防菌NBF188菌株照射處理時間。稀釋倍數為10-4時菌落數量最好統計，總共挑取不少于500個單菌落進行平板抑菌篩選。

2.2? ?ARTP 誘變后高產菌株的篩選

經過3次傳代試驗篩選得到的5株抑菌效果最好、且遺傳穩定性較好的誘變菌株，重復測定抑菌效果。原始菌株作為對照（CK），對茄科勞爾氏菌的抑菌效果及HPLC-MC檢測的多粘菌素特征峰面積結果如表1。其中3號較原始菌株的峰面積比為206.2%，抑菌效果及多粘菌素產量均為最好。將其命名為NBF188-R。

3? ?小結與討論

多粘類芽孢桿菌可產生強抗逆性的內生芽孢，抑菌譜廣，對真菌、細菌、線蟲等引起的植物病害具有防治效果，還能促進植物根際定植，對植物具有促生作用，可增強土壤的通透性，是極具開發潛力的生防菌[8-14]。本試驗通過等離子體誘變篩選到一株高產菌株NBF188-R，將多粘菌素的表達產量提高了1倍，在后續試驗中可以增加田間試驗，進一步驗證菌株NBF188-R防治番茄青枯病的效果。

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（收稿日期：2019-09-15）