RAI14在胃癌組織中的表達及其臨床意義

劉成業 何新陽 金榮 趙亞軍 王曉秋 田銳

【摘 ?要】目的：探索維甲酸誘導蛋白14（Retinoic Acid Induced 14， RAI14）在胃癌組織中的表達水平，并分析其表達水平的臨床意義。方法：通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測2019年1月至2019年3月期間42例胃癌患者的新鮮胃癌組織及其對應的癌旁正常組織標本RAI14 mRNA的相對表達量。另通過免疫組織化學法檢測2011年3月至2013年5月期間于我院胃腸外科病區住院行手術治療的122例患者的胃癌組織及其對應癌旁正常組織標本RAI14蛋白的表達。統計RAI14在胃癌組織中的表達水平，分析其及與患者臨床病理特征的關系。通過單因素、多因素分析，分析胃癌組織中的RAI14表達水平與患者預后的相關性。結果：胃癌組織中RAI14 mRNA的表達水平明顯高于其癌旁正常組織（P<0.05）。免疫組織化學法結果顯示RAI14在胃癌組織中的表達陽性率高于癌旁正常組織（P<0.05）。RAI14陰性組的生存率高于陽性組（P<0.05）。腫瘤的分化程度、直徑、浸潤深度、淋巴結轉移數量與胃癌組織RAI14蛋白的過度表達有關（P<0.05）。單因素分析顯示腫瘤RAI14表達異常、腫瘤直徑、浸潤深度、分化程度以及淋巴結轉移數目與胃癌患者預后存在一定的相關性（P<0.05），Cox多因素分析可見RAI14表達異常、浸潤深度以及淋巴結轉移數是影響胃癌患者預后的獨立因素（P<0.05）。結論：胃癌組織中存在明顯的RAI14異常表達，RAI14過表達與胃癌的發生、發展存在一定的相關性，也有助于判斷胃癌患者的預后，因此RAI14有望成為一項新型的胃癌腫瘤標記物。

【關鍵詞】RAI14;胃癌;qRT-PCR;免疫組織化學法;預后

【中圖分類號】R197??????【文獻標識碼】A??????【文章編號】1004-7484（2019）07-0078-03

Expression of RAI14 in gastric cancer tissues and its clinical significance★

LIU Chengye， HE Xinyang*， JIN Rong， ZHAO Yajun， WANG Xiaoqiu， TIAN Rui

（Department of general surgery， provincial hospital affiliated to anhui medical university， Hefei， Anhui， 230001， China）

【Abstract】Objective： To explore the expression of 14 （Retinoic Acid Induced 14， RAI14） in gastric carcinoma and to analyze its clinical significance. Methods：?Real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the relative expression of RAI14 mRNA in 42 fresh gastric cancer tissues and their corresponding normal adjacent tissues from January 2019 to March 2019. The expression of RAI14 protein in gastric cancer tissues and corresponding normal tissues of 122 patients hospitalized in gastrointestinal surgery ward of our hospital from March 2011 to May 2013 was detected by immunohistochemical method. The expression level of RAI14 in gastric cancer was analyzed and its relationship with clinicopathological features was analyzed. The correlation between RAI14 expression and prognosis in gastric cancer was analyzed by univariate and multivariate analysis. Results：?The expression level of RAI14 mRNA in gastric cancer tissues was significantly higher than that in paracancerous normal tissues （P < 0.05）. The positive rate of RAI14 expression in gastric cancer tissues was higher than that in adjacent normal tissues （P < 0.05）.The survival rate of RAI14 negative group was higher than that of positive group（P < 0.05）.The degree of differentiation， diameter， depth of invasion and the number of lymph node metastasis were related to the overexpression of RAI14 protein in gastric cancer（P<0.05）.Univariate analysis showed that abnormal expression of RAI14， tumor diameter， depth of invasion， degree of differentiation and number of lymph node metastasis were correlated with prognosis of patients with gastric cancer （P < 0.05）. Cox multivariate analysis showed that abnormal expression of RAI14， number of lymph node metastasis and depth of invasion were independent factors affecting the prognosis of patients with gastric cancer. Conclusion：There is obvious abnormal expression of RAI14 in gastric cancer. There is a certain correlation between the overexpression of RAI14 and the occurrence and development of gastric cancer， and it is also helpful to judge the prognosis of patients with gastric cancer. RAI14 is expected to become a new type of gastric cancer tumor marker.

【Key words】?Retinoic acid induced 14 （RAI14）; Gastric cancer; RT-PCR; Immunohistochemical method; ?Prognosis

前言

胃癌是世界上最常見的高發病率腫瘤之一，其致死率在所有癌癥中也高居第三位^[1-5]。與此同時，相關統計數據顯示：在我國，胃癌發病率和死亡率均高居第二位^[6]。因為早期胃癌大多無癥狀或癥狀輕微，所以當臨床癥狀明顯時大部分胃癌患者已處于進展期，因此失去了最好的治療機會，而且這些患者的總體預后很差^[7-9]。目前胃癌的主要治療手段是以手術為中心的多學科綜合治療^[10]，但因其易復發，遠處轉移和產生化療耐藥性，胃癌的總的5年生存率僅為35.9%左右^[11]，因此找到一個可以用于胃癌診斷和治療，并且可以評估患者預后的標志物，成為臨床研究的重點。

維甲酸誘導蛋白14（Retinoic Acid Induced 14，RAI14）是通過對視黃酸誘導人類視網膜色素上皮細胞（RPE）細胞系ARPE-19發現并克隆對新基因^[12]。最近的研究表明，維甲酸誘導蛋白14可能在化療耐藥性，癌細胞增殖和某些惡性腫瘤侵襲過程中發揮關鍵作用，然而，有關RAI14在胃癌中的表達水平、臨床預后意義以及其與腫瘤血管生成的潛在機制尚未得到充分研究。本研究檢測了胃癌組織和對應癌旁正常組織中RAI14的表達，分析了RAI14在胃癌組織中的表達情況，并探討其與胃癌患者的臨床病理特征、參數以及生存率等資料之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1月至2019年3月間在中國科學技術大學附屬第一醫院胃腸外科病區手術治療的42例胃癌患者的癌組織及對應的癌旁正常組織（距腫塊邊緣距離>5cm）標本，手術切除病灶后，迅速將新鮮病灶組織置于無菌試管中，-80℃保存備用，用于qRT-PCR檢測;另選取2011年3月至2013年5月在中國科學技術大學附屬第一醫院122例行手術治療的患者的胃癌組織和癌旁正常組織標本，其中男性83例，女性39例。年齡為29～81歲，中位年齡61歲。標本經固定、包埋、切片后進行免疫組織化學法檢測。本研究所有病例均為原發性胃癌，不包括家族腫瘤的遺傳史，術前未進行放療和化療。術后病理證實為胃腺癌。

1.2 主要試劑與儀器

PCR試劑與儀器：Life Technogies公司提供的TRIzolRNA 抽提試劑盒，上海聯邁生物提供的pcr引物，廣州東盛生物科技提供的逆轉錄試劑盒，羅氏公司的LightCycler 96熒光定量PCR儀及其配套的熒光定量PCR試劑盒。

免疫組織化學試劑與儀器：艾博抗（上海）貿易提供的一抗體兔抗人Rai14，福州邁新生物提供的新型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物、基因科技（上海）提供的DAB顯色盒及免疫組織化學染色試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測 ?按照產品使用說明，將得到癌旁正常組織和癌組織分別稱重，切碎，在液氮中研磨，并加以TRIzol試劑進行裂解處理。加入氯仿，劇烈振蕩，放置室溫下。 4℃條件下，以 12000rpm轉速離心，收集上清（約500ul），并加入異丙醇進行混勻。冰上孵育。再次離心后棄去上清液。 加入預冷的 75℅乙醇。4℃ 12000rpm離心，棄上清。 重復步驟上述步驟，RNA沉淀在室溫下干燥，提取出總RNA，并保存在-80℃條件下備用。使用逆轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，以此為熒光定量模板，用熒光定量PCR試劑盒進行檢測PCR。RAI14基因的特異引物：順向5‘端引物5‘- GGAAGCCAGTGATGAAGCTG -3‘;反向3‘端引物5‘- TCAGCCTGGGCTTCTTTGTA -3‘;長度111 bp;基因的定量分析使用β-actin作為對照，順向5‘端引物5‘- CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3‘;反向3‘端引物5‘- GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3‘;長度96 bp。RAI14 mRNA的相對表達量運用2 -ΔΔCt 法進行計算。

1.3.2 免疫組織化學染色及其評價 ?將組織切片現經二甲苯脫蠟后 再予以濃度梯度酒精置換后，然后選取磷酸緩沖鹽溶液（PBS）進行沖洗。常溫下用3%H₂0₂?進行孵育10 min左右，再選取95°C檸檬酸緩沖液（pH6.0）進行沖洗以修復抗原，繼續在室溫下加入非免疫性山羊血清孵育15min左右，以達到阻斷非特異性免疫反應的作用。將組織表面滴加（將稀釋成1：100的一抗兔抗人RAI14低于切面上，并在4℃條件下孵育過夜。第二天復溫0.5h，PBS緩沖液沖洗3次，加入二抗，孵育0.5h后滴加新鮮的DAB顯色劑進行顯色，隨后用蘇木精復染，流水沖洗，脫水干燥并封固，最后在顯微鏡下觀察結果。

1.4 結果判定 ?光鏡下觀察整個切片，每例切片隨機選擇5個高倍鏡視野（×200），根據切片陽性染色強度分級及細胞染色比例分級的總評分進行判定結果。其中無著色、淡黃色、棕黃色以及棕褐色的陽性細胞染色強度分別為0、1、2、3分;陽性細胞染色比例占比0%、不足20%、20～50%、高于50%的評分分別為0、1、2、3分。總分≤2分為陰性，即低表達）;總分>2分視為陽性，即高表達。

1.5 隨訪 ?對患者進行隨訪，隨訪的方式包括門診或電話等，隨訪截止時間2018年12月。

1.6 統計學分析 ?采用SPSS21.0軟件進行統計學分析。計量資料以t檢驗;計數資料通過χ2檢驗分析;RAI14的過表達與胃癌患者總生存期（OS）的相關性應用Kaplan-Meier生存曲線進行分析;并對胃癌患者預后的相關因素進行單因素分析及Cox回歸多因素分析。P<0.05即差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RAI14 mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達

圖1可見胃癌組織中RAI14 mRNA的表達水平為（8.48±7.46）顯著高于其癌旁正常組織的（2.52±3.19），差異有統計學意義（t=4.976，P<0.05）。

2.2 ?RAI14蛋白在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達情況

表1，圖2顯示RAI14在胃癌組織中的表達陽性率為72.2%（88/122），高于癌旁正常組織的30.4%（37/122），差異有統計學意義（χ²=42.665，P<0.05）。

2.3 ?RAI14蛋白在胃癌組織中的表達水平與臨床病理特征的關系

表2可見，腫瘤的分化程度、直徑、浸潤深度、淋巴結轉移數量與胃癌組織RAI14蛋白的過度表達有關（P<0.05）。而年齡、性別差異與RAI14蛋白的過度表達無關（P>0.05）。

2.4 ?RAI14蛋白在胃癌組織的表達水平與胃癌患者預后的關系

Kaplan-Meier生存曲線分析可見RAI14陰性組的生存率高于陽性組（χ²=10.939，P<0.05）。表3的單因素分析顯示腫瘤RAI14表達異常、腫瘤直徑、浸潤深度、分化程度以及淋巴結轉移數目與胃癌患者預后存在一定的相關性（P<0.05），表4的Cox多因素分析可見RAI14表達異常、浸潤深度以及淋巴結轉移數是影響胃癌患者預后的獨立因素（P<0.05）。

3 討論

胃癌是一種全球常見的實體惡性腫瘤，其預后差，容易復發和發生轉移，嚴重影響人類健康^[12]。RAI14基因是由Kutty等于2001年發現的^[13]，該基因定位于5p13.2～13.3，由于不同的剪切機制，其轉錄產物有5kb和3kb左右兩種形式，在人和小鼠中具有很高的同源性，達到91%。在人類中，其cDNA全長4925bp，編碼980氨基酸，蛋白大小約110kDa。值得注意的是，RAI14蛋白結構上有兩個重要特點：一是在蛋白的C端有一個大的螺旋-螺旋結構域，覆蓋了整個蛋白質的60%，這樣的結構特點成為蛋白自身聚合或與其它蛋白相互作用的基礎;第二是在N端有6個重復的錨蛋白序列（每個重復序列包含33個氨基酸），它們是蛋白質相互結合的場所。同時Kutty應用Nothern blotting和原位雜交進一步發現，該基因在多種腫瘤細胞（腺性結腸癌SW480、肺癌細胞A549、淋巴瘤K-562、Hela cell s3等）也有高表達，這一結果提示RAI14基因可能在細胞增殖以及腫瘤的發生中承擔著重要角色^[13]。

最近的研究表明，RAI14可能在化療耐藥性、癌細胞增殖和某些惡性腫瘤侵襲過程中發揮關鍵作用。例如，Hsu等進行了全基因組分析以鑒定與抗腫瘤藥物（包括紫杉醇、多西紫杉醇、厄洛替尼、依維莫司和達沙替尼）顯著相關的一組8個基因，（EGFR、ITGA3、MYLK、RAI14、AHNAK、GLS、IL32和NNMT）^[14]。Hawkins等發現NR2F2可以通過調節NEK2、RAI14參與卵巢癌細胞周期相關的多種基因的表達^[15]。Paez等已經證明RAI14參與前列腺癌細胞骨架的調節^[16]。此外，Zhou等結合生物信息學和實驗驗證的方法鑒定出RAI14是胃癌中與藥物反應相關的基因之一^[17]。然而，在肺腺癌中發現不一致的現象，Yuan等發現RAI14肺癌組織及細胞系A549高表達，但高表達RAI14顯著抑制了肺腺癌細胞增殖^[18]。

胃癌具有較強的富血管性，其生長和轉移依賴于新生血管的生成^[19-21]。理論上，血管靶向治療是一種有效的抗癌途徑。然而，臨床實踐表明抗血管生成藥物對晚期胃癌患者生存期的影響十分有限，目前被臨床證實有效的小分子靶向藥僅有阿帕替尼一種^[22-25]。因此，找尋新的抗血管生成治療靶點也一直是胃癌研究領域的重點方向之一。

本研究通過胃癌組織和癌旁正常組織中RAI14 mRNA表達和RAI14蛋白表達情況進行對比，發現癌組織中RAI14 mRNA的表達和RAI14蛋白表達均要顯著高于癌旁正常組織。進一步分析顯示腫瘤的分化程度、直徑、浸潤深度、淋巴結轉移數量與胃癌組織RAI14蛋白的過度表達有關（P<0.05）。而RAI14陰性組的生存率高于陽性組（P<0.05）。單因素和Cox多因素分析顯示RAI14表達異常、浸潤深度以及淋巴結轉移數是影響胃癌患者預后的獨立因素（P<0.05）。結果提示胃癌組織中存在明顯的RAI14異常表達，這種異常表達與胃癌的發生、發展存在一定的相關性，且對于判斷胃癌患者的預后也能提供一定的參考價值。

綜上所述， 胃癌組織中存在明顯的RAI14異常表達，RAI14過表達與胃癌的發生、發展存在一定的相關性，也有助于判斷胃癌患者的預后，因此RAI14有望成為一項新型的胃癌腫瘤標記物。基于上述科學理論，接下來我們將圍繞RAI14參與調控胃癌血管生成作用及機制進一步探索與研究。

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項目基金：

安徽省自然科學基金項目（項目編號：1908085MH282）;CSCO-恒瑞腫瘤研究基金資助項目（項目編號：Y-HR2017-021）