SOCS2在1型糖尿病腎病腎小管上皮細胞間質轉分化中的作用①

孫 翼 高永棣 董 蓉 俞佳麗 查 艷

(貴州醫科大學免疫學教研室,貴陽 550004)

我國1型糖尿病研究組研究顯示，中國仍然是全球1型糖尿病(Type 1 diabetes,T1D)發病率最低的國家之一，但過去20年間，15歲以下兒童發病率增加近4倍，新發的成人病例也不容小覷[1]。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是T1D的常見并發癥之一，也是終末期腎病的最常見原因，影響著近15%～25%的T1D患者最終發展為DN[2]。因此，積極探索與DN相關的發病機制，尋求新型有效的預防及治療策略來阻止DN向終末期腎病發展具有重要意義。

細胞因子信號傳導抑制因子(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)主要由各種細胞因子誘導產生，SOCS信號參與免疫細胞的調節[3]。細胞因子信號傳導途徑的失調與多種自身免疫性疾病，包括系統性紅斑狼瘡，類風濕性關節炎和T1D等的發展和發病機理相關。在T1D發病過程中，過度活化的T細胞和巨噬細胞產生的促炎細胞因子可能導致β細胞的破壞和死亡[4]。近年來，已有學者證明SOCS2是β細胞中胰島素原加工和胰島素分泌的有效調節劑[5]。SOCS2失衡就可能導致很多疾病，如心血管疾病，胰島素抵抗，癌癥和嚴重感染等[6]。然而，SOCS2在T1DN腎小管上皮細胞間質轉分化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)導致腎臟纖維化中的作用還尚不明確。本實驗通過成功建立T1DN小鼠模型，檢測并分析SOCS2和腎臟纖維化相關蛋白的表達水平，探討在T1DN發病過程中SOCS2對EMT的作用，為DN的新型治療分子提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 STZ購自Sigma公司，鹽酸貝那普利購自北京諾華制藥有限公司，胰島素注射液購自江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司。尿蛋白試劑盒購自BioAssay Systems，兔E-Cadherin多克隆抗體、兔FN多克隆抗體、兔SOCS2多克隆抗體、HRP標記山羊抗兔IgG均購自MDL公司，E-Cadherin、FN、SOCS2原位雜交試劑盒購自武漢博士德公司。6周齡C57/BL6雄性小鼠(n=28,18～22 g)購自重慶騰鑫生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(軍)2012-0011。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組、標本收集 28只C57/BL6雄鼠適應性飼養2周后，隨機分對照組(n=7)和T1D組(n=21)，均普通飼料喂養，自由飲水。T1D組禁食24 h，自由飲水，單次空腹腹腔注射100 mg/kg 鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)，48 h后取尾靜脈血測血糖，隨機血糖測定結果≥16.7 mmol/L為T1D建模成功。將21只T1D小鼠再隨機分為T1DN組(n=7)；貝那普利+胰島素聯合組(n=7)，聯合給予皮下注射1～2 U/(kg·48 h) 胰島素和10 mg/(kg·48 h) 貝那普利灌胃8周；胰島素(Insulin)組(n=7)，皮下注射1～2 U/(kg·48 h)胰島素8周。持續給藥8周后收集24 h尿液(加防腐劑)測24 h尿蛋白。處死當天記錄各組小鼠空腹血糖值，水合氯醛麻醉，采血灌注后，取雙腎，用10%中性甲醛溶液固定過夜，常規石蠟包埋，制成石蠟切片。

1.2.224 h尿蛋白測定 記錄24 h尿量后，用尿蛋白試劑盒(比色法)測得尿蛋白濃度，按24 h尿蛋白=尿蛋白濃度×24 h尿量，算出24 h尿蛋白。

1.2.3天狼星紅染色染色(Sirius red staining,SR) 2～3 μm石蠟切片脫蠟至水化，Weigert鐵蘇木素染液染色10 min，自來水洗，天狼星紅染液滴染1 h，自來水浸泡，脫水、透明、封片。

1.2.4免疫組織化學 4 μm石蠟切片脫蠟至水化，3%過氧化氫降低內源性酶活性，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復后，E-cadherin(1∶500)、FN(1∶500)、SOCS2(1∶200)抗體4℃孵育過夜，另設PBS代替一抗作陰性對照。復溫后充分洗滌，兔二步法二抗室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復染，封片。每個實驗分別進行獨立重復實驗3次。光學顯微鏡下拍照，每張切片隨機選取10個視野，用Image-Plo Plus 6.0圖像處理軟件分析，計算累積光密度IOD值。

1.2.5原位雜交 4 μm石蠟切片脫蠟至水化，3%H2O2滅活內源性酶，暴露mRNA片段后固定。42℃預雜交4 h后，加雜交液與組織細胞中的待測核酸雜交，38℃雜交過夜。洗滌加封閉液，生物素化鼠抗地高辛標記消除內源性背景，SABC、生物素化過氧化物酶、DAB顯色，脫水透明封片。每個實驗分別進行獨立重復實驗3次。光學顯微鏡采集圖片，每張腎組織切片隨機選取10個視野，用Image-Plo Plus 6.0圖像處理軟件，算出平均光密度。

2 結果

2.1小鼠空腹血糖值及24 h尿蛋白的變化 T1DN組空腹血糖值(21.70±2.26)mmol/L明顯高于對照組(3.81±0.24)mmol/L(P<0.001)，而聯合組(11.84±0.69)mmol/L和Insulin組(13.05±0.81)mmol/L的空腹血糖明顯下降(P<0.001)，見圖1A。T1DN組24 h尿蛋白[(286±42.41)μg/24 h]明顯高于對照組[(32±4.68)μg/24 h](P<0.001)，而聯合組[(173±17.83)μg/24 h]尿蛋白明顯減少(P<0.001)，Insulin組[(262±34.40)μg/24 h]作用不明顯，見圖1B。

2.2小鼠腎臟病理改變 SR染色觀察腎組織膠原纖維沉積情況，如圖2所示，對照組腎小球及腎小管結構完整清晰，基底膜完整，腎小管間質未見膠原纖維沉積；T1DN組腎小球肥大增生、腎小管上皮損傷，間質膠原纖維的沉積明顯增加(P<0.001)；聯合組腎小管結構基本完整，腎小管間質膠原纖維沉積明顯減少，肥大程度明顯減輕(P<0.001)，而Insulin組的效果不明顯。

2.3小鼠腎組織E-cadherin和FN mRNA與蛋白質表達變化 組織原位雜交結果顯示(圖3A)，T1DN組腎組織腎小管上皮細胞E-cadherin mRNA表達明顯減少(P<0.001)， FN mRNA表達明顯增加(P<0.001)，表明T1DN病變時腎組織腎小管上皮細胞發生EMT；聯合組E-cadherin mRNA表達明顯增加(P<0.001)，FN mRNA表達明顯減少(P<0.001)；而Insulin組作用不明顯(圖3B、C)。

圖1 小鼠空腹血糖與24 h尿蛋白量Fig.1 Levels of fasting blood glucose and 24-hour urine protein in miceNote: ***.P<0.001.

免疫組織化學染色結果顯示(圖4A)，T1DN組E-cadherin蛋白表達明顯減少，FN蛋白表達明顯增多(P<0.001)；聯合組E-cadherin蛋白表達明顯增加，FN蛋白表達明顯減少(P<0.001)；Insulin組作用不明顯(圖4B、C)。

2.4小鼠腎組織SOCS2 mRNA與蛋白質表達變化 組織原位雜交結果顯示(圖5A)，T1DN組SOCS2 mRNA表達明顯增多(P<0.001)，聯合組SOCS2 mRNA表達明顯減少(P<0.001)，Insulin組變化不明顯(圖5B)。

圖2 小鼠腎組織病理變化(SR，×400)Fig.2 Histopathological changes in mice kidneys (SR,×400)Note: ***.P<0.001.

圖3 原位雜交檢測小鼠腎組織中E-cadherin與FN mRNA的表達變化(ISH，×400)Fig.3 In situ hybridization detection of E-cadherin and FN mRNA expression levels in mice kidneys (ISH,×400)Note: ***.P<0.001.

圖4 免疫組織化學檢測小鼠腎組織中E-cadherin、FN 蛋白的表達變化(IHC，×400)Fig.4 Immunohistochemistry detection of E-cadherin and FN protein in mice kidneys (IHC,×400)Note: *.P<0.05,***.P<0.001.

圖5 原位雜交檢測小鼠腎組織中SOCS2 mRNA的表達變化(ISH，×400)Fig.5 In situ hybridization detection of SOCS2 mRNA expression levels in mice kidneys (ISH,×400)Note: ***.P<0.001.

免疫組織化學染色結果顯示(圖6A)，T1DN組SOCS2蛋白表達明顯增多(P<0.001)。聯合組SOCS2 蛋白表達明顯減少(P<0.001)，Insulin組SOCS2 蛋白表達稍減少(P<0.01)(圖6B)。

圖6 免疫組織化學檢測小鼠腎組織中SOCS2 蛋白的表達變化(IHC，×400)Fig.6 Immunohistochemistry detection of SOCS2 protein in mice kidneys (IHC,×400)Note: **.P<0.01,***.P<0.001.

圖7 SOCS2表達量與SR膠原纖維沉積、E-cadherin、FN表達量間的相關性Fig.7 Correlations between SOCS2 expression and SR collagen fiber deposition,E-cadherin and FN expression levels

2.5相關性分析 T1DN小鼠腎組織SOCS2的表達水平與腎組織膠原纖維沉積量呈正相關(r=0.959 6,P<0.001，圖7A)，與腎組織E-cadherin表達量呈負相關(r=-0.719 1,P<0.01，圖7B)，與腎組織纖維連接蛋白FN表達量呈正相關(r=0.630 8,P<0.01，圖7C)。

3 討論

據報道DN的基本潛在機制涉及高糖(High-glucose,HG)誘導一系列細胞內事件，包括活性氧生成，促分裂原活化蛋白激酶活化以及轉錄因子誘導等。通過這些不同的細胞內途徑增強促炎因子和促纖維化因子產生，引發腎損傷和纖維化的修復過程[7,8]。因此，確定可能導致DN的新治療靶點具有重要臨床意義。

越來越多的證據表明，SOCS2的異常表達可能參與了T1D的發展[9]。Lebrun等[5]在組成型產生SOCS2的轉基因小鼠β細胞中發現SOCS2表達擾亂了胰島素原的成熟，產生的SOCS2不足以誘導糖尿病，但它會導致葡萄糖耐受不良，SOCS2的增多可能易于導致β細胞衰竭，表明SOCS2在T1D中發揮著重要作用。SOCS2作為糖尿病的調節因子，敲除SOCS2可以防止鏈脲佐菌素誘導成年雄性小鼠的T1D，可能是通過增加β細胞對GH的超敏反應，對胰腺β細胞產生保護作用[10]。另有研究報道，上皮細胞向間充質細胞的轉分化，稱為上皮-間質轉化EMT過程，在發育、傷口愈合的過程中是不可或缺的，并且在病理學上導致纖維化和癌癥進展，也就是說EMT在糖尿病并發癥DN的腎臟纖維化發展過程中起著很重要的作用[11-13]。然而，SOCS2在T1DN中對EMT的作用尚未有報道。本研究通過STZ成功誘導T1DN小鼠模型，用原位雜交技術和免疫組化檢測了腎組織SOCS2的表達，發現SOCS2在T1DN 組中上調。為了揭示SOCS2在EMT導致纖維化過程中的作用，本研究又檢測了纖維化相關指標，首先T1DN組24 h尿蛋白顯著增多，SR染色顯示小球肥大增生、腎小管上皮損傷、結構破壞，間質膠原纖維的沉積。此外，E-cadherin表達減少和FN表達增加，提示EMT發生[13,14]。進一步Pearson分析，SOCS2與腎組織膠原纖維沉積量和FN呈正相關，與E-cadherin呈負相關，提示SOCS2可能參與了T1DN中的EMT過程。

HG誘導腎小球系膜細胞GMCs中的血管緊張素Ⅱ產生，血管緊張素Ⅱ增加血管阻力，減少腎血流量，并刺激GMCs中ECM的產生[15]。近年來，貝那普利作為第3代ACEI類藥物，被廣泛用于腎臟疾病，如腎性高血壓和DN等，已有研究發現貝那普利可通過減少腎臟膠原的合成和抑制腎內的RAS 而減輕腎臟的纖維化[16,17]。因此，本研究另設了貝那普利聯合傳統降糖藥胰島素為聯合組和單獨胰島素用藥為Insulin組，與T1DN組相比，聯合組較Insulin組更好地改善了腎臟組織病變并降低了T1DN小鼠的蛋白尿，同時腎小管間質膠原纖維沉積明顯減少，E-cadherin表達增加和FN表達減少，SOCS2表達減少。初步推測貝那普利聯合傳統降糖藥胰島素可能通過調節SOCS2，一定程度上改善T1DN的纖維化過程，提示SOCS2在T1DN的EMT過程中發揮著重要作用。

總之，SOCS2參與了STZ誘導的T1DN小鼠腎臟的EMT過程，并發揮著重要作用。然而，對于闡明SOCS2在T1DN發病機理中的作用，還需要進一步的細胞學及分子生物學的研究，從而為T1DN的預防和治療構建理論基礎。