水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2的表型與等位基因序列分析

林秋云 丁西朋 謝振宇 賀治洲

摘 ?要??水稻穗頂部小穗退化在水稻生產中普遍存在，嚴重影響了水稻產量。本文對水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2進行表型觀察，同時測序分析突變體paa1-2中已報道的TUTOU1和PAA1基因序列。結果表明，突變體paa1-2穗頂部退化表型是在幼穗發育6期后產生的。突變體paa1-2和野生型的TUTOU1基因序列一致，然而其PAA1基因存在突變，在第1512～1515 bp處存在4個堿基缺失，導致基因移碼突變并使得蛋白翻譯提前終止，PAA1-2可能是已報道PAA1基因的新等位突變基因。

關鍵詞 ?水稻;穗頂部小穗退化突變體;paa1-2;表型;基因中圖分類號??S511.2+1??????文獻標識碼??A

Phenotype and Alleles Sequence Analysis of paa1-2， a Panicle Apical Abortion Mutant in Rice （Oryza sativa?L.）

LIN Qiuyun， DING Xipeng， XIE Zhenyu， HE Zhizhou

Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?The molecular mechanism of panicle apical abortion has important theoretical and practical significance for high and stable yield breeding in rice （Oryza sativaL.）. The phenotype of a rice panicle apical abortion mutantpaa1-2was observed and theTUTOU1and?PAA1gene sequences in the mutantpaa1-2were sequenced. Results showed that the degraded phenotype of the mutantpaa1-2at the top of panicle was produced after the 6th stage of early panicle differentiation. TheTUTOU1 gene sequence in the mutant?paa1-2 was identical to that of wild type. However， there were mutations in thePAA1 gene of the mutant?paa1-2. There were four base deletions at 1512-1515 bp， which led to coding mutations and early termination of protein translation.?PAA1-2maight be a new allele of?PAA1gene.

Keywordsrice （Oryza sativaL.）;?panicle apical abortion mutant;paa1-2; phenotype;?gene

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.012

水稻作為全球約一半以上人口的主食，是發展中國家最重要的糧食作物^[1]。隨著全球人口增多，耕地面積減少，生態環境逐步惡化，提高水稻產量對于滿足糧食需求和保障糧食安全具有很大的意義^[2-5]。每穗粒數是決定水稻產量的重要因素之一，在每株穗數不變的基礎上，增加每穗粒數是提高水稻產量的重要途徑之一^[6-8]。然而，當水稻穗處于小花發育階段時，已經形成的小穗容易發生退化，造成穗子體積減小，穗粒數大幅度減少，此現象被稱為“開花前小花退化”（pre-flowering floret abortion）。穗部退化主要包括2種類型，分別是穗基部小穗退化和穗頂部小穗退化，而穗頂部退化現象在水稻育種過程中更為普遍。研究水稻穗頂部退化發生的分子機制，對水稻的高產、穩產、育種具有重要的理論與實踐意義。

水稻穗頂部退化是一個復雜的數量性狀，且易受到環境因素影響，因此加大了其研究難度。目前對穗頂部退化的研究已有一定的進展，但是大多數研究集中在QTL位點檢測和突變體的精細定位^[9-13]。目前僅有2個穗頂部退化相關的基因被克隆。Bai等^[14]和Heng等^[15]利用突變體成功克隆了2個水稻穗頂部小穗退化相關基因，分別是TUTOU1和PAA1。突變體tutou1表現出一因多效的表型，除了穗頂部發生小穗退化外，還伴隨矮稈、短穗、花器官異常、根變短等特征。通過對不同組織的RT-PCR分析，結果表明該基因在根、莖、葉、小穗中均勻表達，并且表達水平在小穗中是最高的。TUTOU1基因編碼一個有功能的SCAR/WAVE同源蛋白，在水稻穗的發育過程中發揮重要作用。突變體paa1是Heng等^[15]從kitaake組織培養后代中鑒定得到的一個穗頂部退化突變體。經圖位克隆和測序發現，突變體paa1的LOC_Os02g45160基因在一個剪切位點上存在單堿基的突變，導致編碼的蛋白質氨基酸序列發生錯誤。PAA1基因編碼一個鋁激活的蘋果酸轉運蛋白。突變體paa1中PAA1基因的突變導致頂部小穗細胞內蘋果酸含量的降低，引發細胞內的氧化還原平衡遭到破壞，從而有可能導致活性氧（ROS）爆發，引起頂部穗細胞發生死亡，導致突變體paa1頂部小穗的退化。本課題組在前期工作中利用⁶⁰Co-γ射線輻照處理一個來自尼日利亞的秈稻品種SIPI干種子，輻射劑量為300 Gy，隨后種植多代篩選，最終獲得一個穩定遺傳的水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2。本研究對突變體paa1-2進行表型特征觀察分析，同時根據已報道的水稻穗頂部小穗退化相關基因TUTOU1和PAA1的基因組序列設計引物，對野生型和突變體paa1-2進行測序分析等位基因型，以期為控制水稻穗頂端小穗退化的分子機制研究提供參考。

1??材料與方法

1.1材料

利用⁶⁰Co-γ射線300 Gy輻照秈稻品種SIPI（尼日利亞）干種子，隨后多代種植篩選出穩定遺傳的水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2。2018年春季在海南省儋州市中國熱帶農業科學院水稻綜合試驗基地種植野生型和突變體paa1-2，行距設定20 cm，株距設定13.3 cm，單株插秧，與常規大田的水肥病蟲管理方法一致。

1.2方法

1.2.1 ?PCR擴增??PCR總反應體系為30 ?L，其中15.0 ?L Mix（2×Power Taq PCR MasterMix）、12.0 ?L ddH₂O、1.0 ?L forward primer（10 mmol/L）、1.0 ?L reverse primer（10 mmol/L）、1.0 ?L模板DNA。PCR反應程序為：95 ℃?5 min;循環（95 ℃?30 s，58 ℃?30 s，72 ℃?1.5 min）35次;72 ℃?5 min，4 ℃保存。

1.2.2TUTOU1和PAA1基因的等位基因序列測定??在國家水稻數據中心（http：//www.ricedata.?cn/gene/index.htm）檢索TUTOU1和PAA1基因，基因符號分別為LOC_Os01g11040和LOC_Os02g45160，獲得已公布的基因序列，利用Primer 5軟件設計引物，分別擴增出野生型和突變體paa1-2中TUTOU1和PAA1等位基因的DNA片段，回收之后對DNA片段進行測序、拼接和序列比對，基因測序由廣州天一輝遠基因科技有限公司完成。測序結果用seqman軟件拼接，用DNAman 6.0軟件進行比對分析。本研究用于擴增突變體paa1-2中TUTOU1和PAA1基因的Indel標記序列信息見表1。

2??結果與分析

2.1水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2的表型鑒定

水稻穗頂部小穗退化突變體paa1-2在營養生長時期表現正常，與野生型相比沒有明顯的差異。而到抽穗期時，突變體paa1-2穗的頂部小穗出現明顯的退化現象，表現為干癟和壞死狀態，而且突變體的穗一直保持著直立的形態，相反野生型的穗在開花后期就開始彎曲下垂（圖1A，圖1B）。

A：抽穗之后的整株表型;B：抽穗之后的穗部表型;C、D：野生型與paa1-2突變體幼穗發育6期和7期的表型;E、F：表示C、D中所對應的頂部小穗表型。

A： gross morphology of the wild-type （left） and?paa1-2（right） plants after heading; B： panicle morphology of the wild-type （left） andpaa1-2 （right） after heading; C， D： phenotypic of the WT andpaa1-2at the 6th and 7th stage of early panicle differentiation， respectively; E， F： representative spikelets from the top of the corresponding panicles shown in C and D.

為了進一步了解突變體paa1-2頂部小穗發生退化的具體階段，我們根據幼穗分化的8個發育時期對突變體paa1-2的頂部穎花進行觀察。結果發現，突變體paa1-2在幼穗發育6期之前，與野生型相比無明顯差異，而在幼穗發育7期時，paa1-2頂部的小穗發育停滯，仍處于淺白色的狀態，而且paa1-2中部和基部的小穗生長狀態和野生型基本一致（圖1C，圖1D，圖1E，圖1F）。這些結果表明突變體paa1-2穗頂部退化表型是在幼穗發育6期后產生的。突變體paa1-2頂部退化的小穗在籽粒成熟之后幾乎都發生脫落，最終導致產量顯著降低。

2.2水稻穗頂部小穗退化相關基因TUTOU1和PAA1在突變體paa1-2中的基因序列分析

通過對TUTOU1和PAA1這2個基因的序列分析發現，突變體paa1-2和野生型的TUTOU1基因序列一致，而突變體paa1-2的PAA1基因存在突變，測序發現其在第1512～1515 bp處存在4個堿基的缺失（圖2），即第3個外顯子上有4個堿基的缺失，從而引起基因移碼突變，從第424位谷氨酸之后的氨基酸發生改變，蛋白翻譯提前終止（圖3）。且突變體paa1-2與突變體paa1在表型上相似，因此，PAA1-2可能是已被報道的PAA1基因新的等位突變基因。

3??討論

水稻產量是一種復雜的農藝性狀，主要由每株穗數、每穗粒數和千粒重3個因素所決定^[16-17]。水稻育種研究者都一致追求大穗、多粒，這也是育種的主要目標之一。然而水稻育種中普遍出現水稻穗頂部穎花退化現象，導致水稻單產嚴重下降，因此，開展關于水稻穗部退化相關的分子機制研究工作迫在眉睫。目前認為水稻穗頂部小穗退化受環境和生理因素的影響，如外界的溫度、濕度、光照、土壤中的營養條件和不同水稻品種本身的遺傳背景等^[18]，是一個多基因控制的復雜數量性狀。近年來已有很多控制水稻穗頂部退化的QTL位點被報道，但由于QTL位點很難分離，所以通過QTL精細定位找到控制水稻穗頂部退化基因的難度很大，關于水稻穗頂部小穗退化的遺傳和分子機制還知之甚少^[9-13]。

突變體是功能基因組學研究的重要材料，在揭示水稻重要性狀的相關基因及其分子機制研究中具有重要的科學價值^[19-20]。因此通過篩選與鑒定水稻穗頂部小穗退化突變體，有利于加快開展水稻穗頂部小穗退化的分子調控機制研究。本文報道的突變體paa1-2的突變表型與突變體paa1表型相似，其在PAA1基因序列上比野生型少4個堿基，從而引起基因移碼突變并使得蛋白翻譯提前終止，說明PAA1-2很有可能是PAA1的復等位基因。田間表型觀察發現，突變體paa1-2在抽穗前與野生型比較，在外觀上無任何差異，抽穗后明顯表現出穗頂部退化，籽粒成熟之后，突變體頂部退化的小穗幾乎都發生脫落，最終造成株高、穗長、每穗粒數都顯著降低，與突變體paa1的表型一致。

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