茄子冷誘導轉錄因子CBF的分離及分析

姜濤 申艷紅 趙灣灣 林碧英

摘 ?要??利用白菜CBF基因序列搜索茄子基因組DNA序列和茄子EST序列，然后參考這些序列設計開放型閱讀框兩端的特異引物，以茄子葉片cDNA為模板克隆獲得了該基因的cDNA序列。經生物信息學分析證實該序列是CBF基因，命名為SmCBF（登錄號：KY780486.1）。該基因編碼211個氨基酸，包含AP2功能域和DNA結合位點，屬于AP2超基因家族。用PlantCARE分析SmCBF基因啟動子序列的順式作用元件，發現了1個MYC識別位點和1個MYB結合位點，說明該基因受到MYC和MYB的調控。采用Real-time PCR研究了SmCBF基因在低溫誘導茄子中的表達情況，結果顯示該基因隨著低溫處理時間延長表達量逐漸升高，在6 h達到最高值，說明低溫誘導該基因表達。

關鍵詞 ?茄子;CBF基因;基因克隆;熒光定量PCR;啟動子中圖分類號??S641.1??????文獻標識碼??A

Isolation and Analysis of Cold-induced Transcription Factor CBF?from Solanum melongena

JIANG Tao^1，2， SHEN Yanhong¹， ZHAO?Wanwan²， LIN?Biying^2*

1.?College of Horticultural Science and Technology， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao， Hebei?066604， China; 2.?College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou，?Fujian?350002， China

Abstract ?The sequence of the open reading frame ofCBFwas obtained from referenceSolanum melongenagenomic sequence in NCBI using the the sequence ofCBFgene from Chinese cabbage as a query. The full-length cDNA ofCBFwas isolated from?the?leaf of eggplant （primers were designed according to the genome DNA sequence and the EST sequence）， and the cloned gene was designated asSmCBF （GenBank No： KY780486.1）. Using bioinformatic analysis， the?gene was identified as a member of theAP2gene family， which encoding?211 amino acids with?DNA binding site. The cis-acting elements of the promoter sequence ofSmCBFgene were analyzed by PlantCARE. One MYC recognition site and one MYB binding site were found， indicating?that MYC?and MYB?might?be involved in regulating?the expression ofSmCBF. Real-time PCR analysis revealed that the expression level ofSmCBFgene increased gradually with the prolongation of low temperature treatment time and reached the highest value at 6 h， indicating thatSmCBFwas induced by low temperature treatment.

Keywords ?eggplant;CRTbinding factor; gene clone; quantitative real-time PCR; promoter

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.013

茄子（Solanum melongena）是亞洲和非洲許多國家重要的蔬菜作物之一，在我國各地普遍栽培。茄子作為一種喜溫性蔬菜，大多茄子品種不抗寒^[1]。近年來，人們采用節能型塑料日光溫室和塑料大棚在冬春反季節栽培茄子。然而由于我國的棚室結構一般比較簡單，在冬春嚴寒季節，低溫仍然是影響茄子產量和品質的主要因子。尤其是冬季極限低溫和霜凍給茄子生產帶來巨大損失。2016年1月的低溫霜凍，給福建省閩東閩南春早熟設施茄子造成了嚴重的損失，泉州以北的春早熟設施茄子幾乎全軍覆沒;漳州和廈門茄子生產也因低溫而嚴重減產。因此研究茄子的耐寒性，尋找抗寒基因，培育耐低溫品種，對茄子產業意義重大。

植物抗寒性是由基因控制的，寒冷信號會誘導特定基因表達，提高植物的抗寒能力。通過基因工程方法將抗寒相關基因導入植物中能提高植物的抗寒性。CBF（CRT/DRE binding factor）是抗寒相關基因COR（cold-regulated）的轉錄激活因子，是Stockinger等^[2]在擬南芥中首次發現，該基因的蛋白表達產物可以和具有CRT/DRE元件的基因結合，在植物耐寒等抗逆反應中起著“開關”作用，調控下游大量抗冷基因的表達，對增強植物的抗冷能力極為重要。過量表達CBF基因能活化所有帶CRT/DRE元件的冷誘導基因表達，提高抗寒性。目前已經在擬南芥（Arabidopsis thaliana）^[2-3]、番茄（Lycopersicon esculentum）^[4-5]、水稻（Oryza sativa）^[6]等多種植物中發現CBF對抗冷能力的調節作用。本研究克隆茄子CBF基因，并分析了CBF基因序列特性和冷誘導表達情況，為進一步利用基因工程培育茄子抗寒品種提供基因資源。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?植物材料??將T40茄子6葉齡幼苗放在3 ℃培養箱中進行低溫處理，于0、2、6、12 h分別取樣。將茄子第5片真葉取下立即投入液氮中，?80 ℃保存備用。

1.1.2??試劑與菌株??ExTaq、pMD18-T、T₄ DNA連接酶載體購自TaKaRa公司;柱式DNA膠回收試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司;SYBR ExScript^TMRT-PCR購自TaKaRa公司;引物由上海鉑尚生物技術有限公司合成。通用RNA提取試劑盒R1051購自廣州東盛生物科技有限公司。E.coli DH5α菌株由本實驗室培養并保存。其余為國產分析純試劑。

1.2方法

1.2.1 ?茄子CBF基因的克隆與生物信息學分析

將白菜（Brassica rapa）CBF基因序列（登錄號：KJ013591.1）搜索茄子基因組DNA序列，用softberry網站在線預測基因軟件FGENESH對這段DNA序列進行基因預測，找到CBF基因的編碼區。參考茄子EST序列，通過與小白菜（Brassica campestris）、番茄（Solanum lycopersicum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）CBF基因序列比對確定茄子CBF的開放型閱讀框區域（Open Reading Frame， ORF），并在此序列基礎上設計ORF上下游引物和熒光定量引物（表1）。

參考RNA提取試劑盒步驟提取茄子葉片總RNA，將500 ng RNA逆轉錄合成cDNA。吸取cDNA?1 μL作為模板進行PCR擴增，25 μL PCR反應體系包含2.5 μL Ex buffer，2 μL?dNTPs，0.2 μL?ExTaq，0.5 μL引物，1 μL cDNA，ddH₂O補充至25 μL。擴增程序為94 ℃預變性3 min;35個擴增循環的94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;最后72 ℃繼續延伸7 min。然后，將PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將含有目的條帶片段割膠回收，再連接pMD18-T載體，轉化到大腸桿菌感受態細胞中，挑選陽性克隆送到鉑尚生物技術有限公司進行測序。

用DNAMAN?6.0軟件進行基因片段的拼接和蛋白質翻譯;用Primer?5.0軟件進行引物設計;用MEGA 6.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining， NJ）構建分子進化樹。基因同源性搜索、基因預測、轉錄因子分析及蛋白質結構分析均使用在線數據庫，網址見表2。

1.2.2 ?茄子CBF基因啟動子順式元件分析??將SmCBF基因序列與茄子基因組DNA序列進行比對，截取起始密碼子ATG上游的DNA序列即為SmCBF基因啟動子序列。用PlantCARE在線工具分析該段序列的順式作用元件。

1.2.3 ?茄子CBF基因在低溫誘導茄子中的表達分析 ?提取3 ℃低溫處理后0、2、6、12 h幼嫩葉片的總RNA，分別取500 ng逆轉錄為cDNA。在CBF基因3′端非保守區設計引物qCBF-F和qCBF-R，以茄子Actin基因為內參，用Bio-RAD進行熒光定量PCR擴增。反應體系為20 μL：SYBR?Premix ExTaq^TM 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH₂O 8.0 μL。擴增程序為95?℃預變性3 min，40個循環的95?℃變性15 s，55?℃退火30 s，72?℃延伸30?s。每個樣品3次重復，采用2^-ΔΔCT法分析數據。以0?h為對照，分析CBF基因在低溫誘導后的相對表達。用Excel軟件進行分析和作圖。

2??結果與分析

2.1茄子CBF基因的克隆與同源性分析

在NCBI上用白菜CBF基因序列（登錄號：KJ013591.1）搜索茄子Whole-genome shotgun contigs，發現該序列與茄子contig： Sme2.5_?04750.1_1（登錄號：BAUE01047055.1）相似度最高，達71%。在softberry網站，以番茄基因組DNA為參照，用FGENESH軟件對該序列進行基因預測，在1023～2137 bp之間有1個沒有內含子的基因。將該基因序列與Genbank登錄的基因組序列，以及3個EST序列（EST1：FS056692.1;EST2：JZ716995.1;EST3：FS057826.1）進行比對，設計ORF引物CBF-U與CBF-D（表1）。

以茄子葉片cDNA為模板，用CBF-U和CBF-D引物進行擴增，獲得長約700 bp的片段（圖1）。經回收、測序長699 bp，與基因組DNA序列完全一致。將此序列及其編碼的氨基酸序列與其他物種CBF比較，發現有較高同源性，該序列（Solanum melongena，AVC18973.1）與辣椒（Capsicum annuum，NP_001311786.1）、煙草（Nicotiana tabacum，NP_001312746.1）、番茄（Solanum lycopersicum，XP_004234350.1）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，ACJ26754.1）和葡萄（Vitis vinifera，XP_002280097.1）的CBF蛋白同源性為71.17%、70.09%、65.93%、63.76%、62.84%（圖2）。因此確認獲得了茄子CBF基因全長cDNA序列，將其命名為SmCBF，GenBank登錄號為KY780486.1。將茄子CBF氨基酸序列在NCBI網站的CDD搜索進行氨基酸序列結構域分析，發現該蛋白質包含AP2功能域，屬于AP2超基因家族，11個保守的氨基酸殘基是DNA結合位點（圖2）。PlantTFDB轉錄因子分析也確認該蛋白含有DNA結合位點，能夠響應干旱和低溫，提高植物的抗逆性。

2.2茄子CBF蛋白的基本理化性質和結構預測

將茄子CBF基因的cDNA序列翻譯成氨基酸序列，編碼211個氨基酸。Protparam分析可知，蛋白質分子式為C₁₀₄₃H₁₆₀₀N₂₈₀O₃₃₀S₁₀，等電點為4.90，分子量約為23 662.46 ku。用SignalP 3.0 Server進行信號肽預測，發現沒有信號肽序列，不是分泌蛋白。不穩定系數為65.26，屬于不穩定蛋白。蛋白跨膜預測表明為非跨膜蛋白。SmCBF蛋白二級結構的預測顯示，α-螺旋（36.97%）、隨機卷曲（43.13%）、β-轉角（5.21%）和延伸鏈（14.69%）交替分布（圖3）。

2.3茄子CBF蛋白的分子進化分析

利用MEGA6.0的NJ法，將SmCBF與其他12個高等植物的CBF基因的氨基酸序列構建分子進化樹。結果表明，茄子CBF與同一屬的番茄和馬鈴薯CBF蛋白相似性很高，與同一科不同屬的辣椒和煙草相似性較高，與單子葉植物水稻親緣關系最遠（圖4）。

2.4茄子CBF基因啟動子順式作用元件分析

將SmCBF基因起始密碼子ATG上游長度為1099 bp的DNA序列，用PlantCARE分析啟動子順式作用元件，結果見表3。SmCBF基因啟動子順式作用元件主要有1個MYC識別位點、1個MYB結合位點、1個水楊酸應答元件、2個赤霉素應答元件、3個乙烯響應元件和5個光應答元件。這說明茄子SmCBF基因表達受到MYC、MYB、水楊酸、赤霉素、乙烯和光照等因素的調控。

2.5茄子CBF基因在低溫誘導茄子中的表達分析

采用Real-time PCR研究了SmCBF基因在低溫誘導茄子中的表達情況，結果顯示，該基因隨著低溫處理時間延長表達量逐漸升高，在6 h達到最高值，約為未處理時的500倍，在處理后的12 h表達量稍有降低，但仍遠高于0 h，說明低溫促進該基因表達量升高，可能參與茄子的低溫馴化（圖5）。

3??討論

低溫逆境是影響植物生長發育和分布的主要因素之一，每年因寒害造成的園藝作物的減產和品質下降是目前園藝植物生產中亟待解決的一大難題。植物的抗寒性一般受多基因控制，且與品質優劣性狀緊密連鎖，因此采用常規雜交育種很難提高植物抗寒性。利用基因工程改良植物的抗逆性為抗性育種開辟了新途徑，因此抗逆基因的克隆與分析就顯得極為重要。抗寒基因可分為結構基因和調控基因兩大類。結構基因是植物抗寒性直接相關的基因，如冷誘導基因、抗氧化酶基因和脂肪酸去飽和酶基因等^[7];調控基因是通過調控結構基因的表達、寒冷信號傳導等過程來提高植物的耐寒性，如CBF、ZAT10、ICE、b-ZIP、WRKY、NAC等基因^[7-9]。CBF轉錄因子在植物抗寒中具有重要的調節作用^[3]。擬南芥CBF基因缺失型突變體植株的抗冷能力顯著下降，反義CBF1和反義CBF3擬南芥半致死溫度比野生型高1.5 ℃^[10]。將CBF基因導入擬南芥、蘋果和草莓中，能夠在一定程度上提高植株的抗寒性^[11-13]。CBF轉錄因子大量表達能提高植物的抗寒性，是由于它可以特異性地識別并結合DRE/CRT順式作用元件，調控RD17、COR6、KIN2和COR15A等多種基因的表達，而提高植物的抗凍能力^[14]。同時，CBF的表達也受到上游基因調控。茄子SmCBF啟動子順式作用元件分析顯示，包含1個MYC識別位點和1個MYB結合位點。在擬南芥中，bHLH轉錄因子（inducer ofCBFexpression 1，ICE1）可以識別MYC位點，MYB15則與MYB結合位點結合，MYB15與ICE1相互作用共同調節CBF的表達^[15-16]。

本研究克隆了茄子CBF基因，命名為SmCBF。該基因編碼211個氨基酸，包含AP2功能域和DNA結合位點，屬于AP2超基因家族。功能域分析和轉錄因子分析表明，該基因參與植物的應激脅迫反應和植物的低溫馴化過程。茄子CBF蛋白與同一屬的番茄和馬鈴薯CBF蛋白相似性很高。采用Real-time PCR研究了SmCBF基因在低溫誘導茄子中的表達差異，結果顯示該基因隨著低溫處理時間延長表達量逐漸升高，在6 h達到最高值，表達量是未處理時的500多倍。CBF基因家族成員在很多植物中都能夠很快響應低溫誘導，低溫15 min即可誘導擬南芥AtCBF基因的表達，2 h后達到表達高峰^[17];棉花GhDREB1表達高峰也在2 h^[18];黑麥草CBF的表達高峰為2～4 h^[19]。低溫誘導能夠大大提高茄子SmCBF基因的表達量，說明該基因在茄子低溫脅迫應激反應中具有重要作用。茄子SmCBF基因的分離，以及編碼蛋白特性和表達模式的分析，為進一步利用該基因開展抗寒育種提供基因資源和參考。

參考文獻

• 陳建林， 查丁石， 吳雪霞. 低溫脅迫對茄子幼苗生理生化的影響[J]. 中國蔬菜， 2006， 1（11）： 21-23.
• Stockinger E J， Gilmour S J， Thomashow M F. Arabidopsis thaliana?CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE， a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1997， 94（3）： 1035-1040.
• Jaglo-Ottosen K R， Gilmour S J， Zarka D G，?et al. Arabidopsis?CBF1 overexpression induces COR?genes and enhances freezing tolerance[J]. Science， 1998， 280（5360）： 104-116.
• Imai R， Chang L， Ohta A， et al. A lea-class gene of tomato confers salt and freezing tolerance when expressed in Saccharomyces cerevisiae[J]. Gene， 1996， 170（2）： 243-248.
• Zhang X， Fowler S G， Cheng H， et al. Freezing-sensitive tomato has a functional CBF cold response pathway， but a CBF regulon that differs from that of freezing-tolerant Arabidopsis[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology， 2010， 39（6）： 905-919.
• Ito Y， Katsura K， Maruyama K， et al. Functional analysis of rice DREB1/CBF-type transcription factors involved in cold-responsive gene expression in transgenic rice[J]. Plant & Cell Physiology， 2006， 47（1）： 141-153.
• 丁??健. 果樹抗寒性研究進展[J]. 農業科技與信息， 2011（9）： 42.
• Griffith M， Ala P， Yang D S C， et al. Antifreeze protein produced endogenously in winter rye leaves[J]. Plant Physiology， 1992， 100（2）： 593-596.
• Ouellet F， Monroy A F， Sarhan F. Regulation of a wheat actin-depolymerizing factor during cold acclimation[J]. Plant Physiology， 2001， 125（1）： 360-368.
• Novillo F， Medina J， Salinas J. Arabidopsis?CBF1 and CBF3 have a different function than CBF2 in cold acclimation and define different gene classes in the CBF regulon[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2007， 104（52）： 21002-21007.
• Gilmour S J，?Sebolt A M，?Salazar M P，?et al.?Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activaor mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation[J]. Plant Physiology， 2000， 124（4）： 1854-1865.
• 楊麗麗. 根癌農桿菌介導的抗寒基因轉錄因子CBF轉化蘋果的研究[D]. 保定： 河北農業大學， 2006.
• 金萬梅， 董??靜， 尹淑萍， 等. 冷誘導轉錄因子CBF1轉化草莓及其抗寒性鑒定[J]. 西北植物學報， 2007， 27（2）： 223-227.
• 李科友， 朱海蘭. 植物非生物逆境脅迫DREB/CBF轉錄因子的研究進展[J]. 林業科學， 2011， 47（1）： 124-134.
• Chinnusamy， V. Ohta M， Kanrar S， et al. ICE1： a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis[J]. Genes & Development， 2003， 17（8）： 1043-1054.
• Agarwal M， Hao Y， Kapoor A， et al. A R2R3 type MYB transcription factor is involved in the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance[J]. Journal of Biological Chemistry， 2006， 281（49）： 37636-37645.
• Gilmour S J， Zarka D G， Stockinger E J，?et al. Low temperature regulation of the Arabidopsis?CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression[J]. Plant Journal， 2010， 16（4）： 433 - 44 2 .
• Shan D P， Huang J G，Yang Y T， et al. Cotton GhDREB1 increases plant tolerance to low temperature and is negatively regulated by gibberellic acid[J]. New Phytologist， 2007，176（1）： 70-81.
• Tamura K，?Yamada T. A perennial ryegrass CBF?gene cluster is located in a region predicted by conserved synteny between Poaceae species[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2007， 114（2）： 273-283.