番木瓜實生苗兩性株的鑒定及其組培繁殖體系的建立

黎小瑛 謝旭智 沈文濤 言普 庹德財 周鵬

摘 ?要??本研究以多重PCR技術鑒定的番木瓜實生苗兩性株莖尖作為外植體，建立和優化了一套組培苗繁殖體系，解決了成齡側芽來源的無根苗催根難和移栽成活率低的問題。以‘蔬羅‘蜜紅番木瓜品種的實生苗，通過多重PCR鑒定出兩性株，將其莖尖培養于MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖?30 g/L+瓊脂?6 g/L（pH?5.8）上，在28?℃、2000?lx條件培養30 d后，繼代于MS+BA 0.5 mg/L+KT 0.25 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L（pH?5.8）上，在28?℃、2000 lx條件下培養30 d形成較為強壯的無根苗，接種于1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.05 mg/L+KT 0.01 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂?6g/L（pH?5.8）上進行催根，在28?℃、1500 lx條件下培養20 d后，用不同濃度營養生根水和不同處理時間對‘蔬羅‘蜜紅無根苗進行移栽試驗，以確定最佳催根率和移栽成活率的濃度和時間。研究結果表明：多重PCR技術鑒定性別的準確率達98%以上，‘蔬羅在50 mg/L營養生根水和8 h處理條件下獲得催根率為81.1%、移栽成活率為91.1%。而‘蜜紅品種則催根率為60%、移栽成活率為86.7%。因此利用這一技術獲得的結果相比成齡側芽優勢明顯，可用于番木瓜種苗的商業化生產。

關鍵詞 ?番木瓜;實生苗;性別鑒定;催根率;移栽成活率中圖分類號??S667.9??????文獻標識碼??A

Identification and Establishment of Tissue Propagation System of Hermaphroditic Strains of Papaya Seedling

LI Xiaoying¹， XIE Xuzhi¹， SHEN Wentao^1，2， YAN Pu^1，2， TUO Decai^1，2， ZHOU Peng^1，2*

1. Institute of Tropical Biotechnology and Bioscience， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences?/?Hainan Academy of Tropical Agriculture Resource， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?In this study， the apical stem of the hermaphroditic strain of papaya seedlings identified by multiple PCR technique was used as the explants to establish and optimize a set of propagation system of papaya seedlings in tissue culture. The problem of rootless seedlings and low survival rate of transplanting were solved. In the experiment， the hermaphrodite plants were identified by multiple PCR and the stem tips were cultured on MS supplement with BA 0.5 mg/L， NAA 0.1 mg/L， sucrose 30 g/L， agar 6g/L （pH?5.8）， and cultured at 28?℃for 30 days. The rootless seedlings were formed and?subdivided into small clusters and planted on the strong seedling medium MS supplement with BA 0.5 mg/L， KT 0.25 mg/L， NAA 0.1 mg/L， sucrose 30 g/L， agar 6g/L （pH 5.8）， cultured at 28?℃and 2000 lx for 30 days. The rootless seedlings?were inoculated on the 1/2MS supplement with IBA 0.75 mg/L， NAA 0.05 mg/L， KT 0.01 mg/L， sucrose 30?g/L， agar 6?g/L （pH 5.8） medium. After being cultured at 28?℃and 1500 lx for 20 days. In order to obtain the best rooting rate and survival rate of transplanting， the rootless seedlings were tested with different concentrations of nutrient rooting water and different treatment time. The results showed that the accuracy of multiple PCR technique for sex identification was over 98%. Under the conditions of 50 mg/L nutrient rooting water and 8 h treatment， the rooting rate of ‘Solo was 81.1%， and the survival rate of transplanting was 91.1%. The rooting rate of ‘Mihong was 60% and the survival rate of transplanting was 86.7%. The results obtained by the technique are superior to those of mature lateral buds， and could be used in the commercial production of papaya seedlings.

Keywords ?papaya; seedling; sex identification; root-inducing rate; transplant survival rate

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.014

番木瓜（Carica papaya L.）屬番木瓜科番木瓜屬植物，為熱帶、南亞熱帶常綠軟木質大型多年速生草本果樹，常規生產種植使用種子培育的實生苗，由于其種性復雜，一般分為雌株（占20%～30%）、兩性株（占60%～70%）和雄株（占3%～5%）。兩性株所結果實由于其果肉厚、果形美觀均一等特點具有商品價值。因此，利用種子培育實生苗應用于實際生產中時，等株性明確后必須采取“除雄去雌補種兩性”的工序，這會造成財力、人力的浪費，大大增加了生產成本。成齡側芽組織培養技術可解決這一番木瓜生產上的問題，但由于該技術存在外植體滅菌難、催根難和移栽成活率低等問題，使得這一技術未能取代種子實生苗而規模化應用于生產中^[1-3]。

實生苗莖尖組織培養技術由于番木瓜苗期性別鑒定技術的研究而得到了開發。何堯聲等^[4]利用分子標記技術篩選獲得了番木瓜性別特異SCAR標記的基因片段：番木瓜雄株特異基因片段（1001 bp）、兩性和雄性的特異基因片段（225 bp）設計引物，對番木瓜苗期株性進行了多重PCR鑒定，其準確率幾乎達到100%，用這一技術鑒定番木瓜實生苗株性是完全可行的。但單株批量性別鑒定兩性實生苗，用于實際生產中明顯存在成本提高的問題，而基于番木瓜實生苗性別鑒定技術的組織培養種苗繁育體系的研究至今未見報道。

番木瓜品種‘蔬羅是主栽品種，生產上對優質種苗的需求量較大;‘蜜紅品種是三亞緣之海公司用‘小白和美國‘line品種雜交選育的品種，由于含糖量高（>15%）、有蜂蜜奶香味，近年來頗受消費者的青睞，果品的需求量大，種苗的需求量也大。因此，本研究利用多重PCR技術鑒定篩選這2種番木瓜的兩性株進行組織培養種苗繁育，建立和優化番木瓜實生苗兩性株組培苗繁殖體系，不僅能解決成齡側芽來源的無根苗催根難和移栽成活率低的問題，而且有利于番木瓜實生苗組培種苗的規模化生產和應用，這對促進番木瓜生產和相關產業的發展具有重要的現實意義。

1??材料與方法

1.1材料

每年9—11月份選擇晴天午后3：00—5：00，從中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所番木瓜課題組實驗田栽培的‘蔬羅‘蜜紅母株上采集外表呈“三畫黃”的番木瓜果實，用無菌水清洗番木瓜3次，轉移到超凈臺后，用70%酒精仔細擦洗果實表面;若果實較小，也可將整個番木瓜放入6%次氯酸鈉溶液里浸泡，盡量使其淹沒，過程中加以搖晃，8 min后取出，用無菌水泡洗4～5次;把消毒紙墊在番木瓜下面后，用消過毒的刀子慢慢切開番木瓜，取出種子放到無菌濾紙上晾曬，然后用鑷子把種子表面的膜去除，直接播種到MS或繼代培養基中，每瓶培養基宜播種5～8粒種子，27～28?℃，1500 lx光照12 h培養2～3周形成小苗備用。

預備實驗中選擇‘蔬羅（A）、‘日升（B）、‘穗中紅（C）、‘臺農2號（D）、‘蜜紅（F）等5個品種（系）大田兩性株、雄株和雌株的嫩葉提取DNA進行多重PCR驗證。本預備實驗中成齡植株兩性株的DNA提取方法參照文獻[4]。

營養生根劑：雙吉爾-GGR（含氨基酸水溶肥料）為北京艾比蒂生物科技有限公司產品。

1.2方法

1.2.1??實生苗性別鑒定??（1）實生苗葉片DNA提取??培養20 d后種子萌發出幼苗，選取10株番木瓜幼苗分別在培養瓶底編號為1～10。在超凈臺用消過毒的剪刀剪下1～2片嫩葉（約100～200 mg），裝入相應編號的離心管里。采用TIANGEN公司生產的植物基因試劑盒提取總DNA，具體操作方法見產品說明書。

（2）性別鑒定特異引物合成??參考文獻[4-5]利用分子標記技術篩選獲得的番木瓜性別特異SCAR標記的基因片段：番木瓜雄株特異基因片段（1001?bp）、兩性和雄性的特異基因片段（225?bp）設計并合成引物。225 bp引物：P1 5?-GCACGATTTAGATTAGATGT-3?;P2 5?-GGAT?AGCTTGCCCAGGTCAC-3?。1001 bp引物：P3 5?-GGGCTAGTCAATGTGCTAATGG-3?和P4 5?-G?GGCTAGTCATCACTATCGC-3?。

（3）多重PCR擴增和電泳分析??預備實驗：選擇‘蔬羅（A）、‘日升（B）、‘穗中紅（C）、‘臺農2號（D）、‘蜜紅（F）等5個品種（系）兩性株、雄株和雌株進行多重PCR驗證實驗。采用25 ?L反應體系：Taq酶Mix緩沖液12.5 ?L，4種引物各0.5 ?L，基因組DNA 1 ?L，補足ddH₂O至25 ?L。擴增反應：94?℃，3 min后，進行94?℃，30 s;55?℃，30 s;72?℃，1 min;30個環循。1.5%瓊脂糖凝膠電泳：在120 V電壓下電泳20 min。電泳結束后，將凝膠放入凝膠成像儀里觀察分析多重PCR擴增結果。

檢測實驗：采用上述同樣方法對‘蔬羅‘蜜紅無菌實生苗進行多重PCR擴增，按事先編號對所屬材料進行擴增及電泳分析，記錄屬于兩性株的番木瓜實生苗編號，取其莖尖作為下一步組織培養繁育的材料。

1.2.2??實生苗兩性株無根苗誘導及繁殖??取經性別鑒定為‘蔬羅‘蜜紅兩性株的幼苗莖尖，接種于MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L（pH=5.8）上，在28?℃、2000 lx條件培養約30 d形成叢芽，分割成小叢芽接種于MS+BA 0.5 mg/L+KT 0.25 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂?6g/L（pH=5.8）上，在28 ℃、2000 lx條件培養30 d進行繼代及壯苗培養。

1.2.3 ?實生苗兩性株生根誘導及移栽試驗??對檢驗獲得的‘蔬羅番木瓜兩性實生苗莖尖進行繼代培養，待擴繁獲得繼代苗并壯苗后，將無根苗分單株接種于1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.05 mg/L+KT 0.01 mg/L+蔗糖?30? g/L+瓊脂6 g/L（pH=5.8）上，每次試驗接種30株，重復3次。其次利用對比試驗將蔬羅無根苗浸泡在濃度梯度分別為10、25、50、75 mg/L的營養生根水中6 h，確定成苗率最高的生根水濃度，再以此濃度做不同梯度浸泡時間試驗，分別為2、4、6、8 h，最終確定成苗率最高的生根水浸泡時間。

挑選生根培養基里長勢良好的‘蔬羅木瓜苗，根據1.2.3獲得的生根水最佳催根濃度與最佳浸泡時間浸泡木瓜苗，分3次移栽，每次分別移栽了38、36、39株，做好試驗記錄，統計實生苗兩性株的移栽存活率。

以上催根試驗同時以‘蜜紅品種作對比驗證。

1.2.4??實生組培苗田間株性鑒定??經多重PCR篩選出的實生兩性株經過組培苗培育移栽田間4個月，待其開花結果時從花型上觀察性別，以此來驗證PCR技術鑒定的番木瓜實生苗性別的準確性。

1.3數據處理

利用Excel軟件和SAS軟件對試驗得到的相應數據進行方差顯著性分析。

2??結果與分析

2.1利用多重PCR鑒定實生苗性別結果

多重PCR預備實驗擴增結果如圖1。以雄株總DNA為模板得到1條1001 bp和1條225 bp的擴增產物帶，以雌株總DNA為模板無擴增產物，以兩性株總DNA為模板得到1條225 bp的擴增產物帶。將多重PCR擴增獲得的1001 bp和225 bp的擴增產物回收、克隆并送到大連Takara公司進行測序，應用Vector NTI 9.0分析軟件對測序后的序列進行分析，測序后的序列與番木瓜性別特異基因序列的同源性達到99%以上。可見根據多重PCR擴增結果，能夠準確地將番木瓜兩性株鑒定出來，可用于番木瓜種子實生苗兩性株的篩選。

利用上述方法對10株‘蔬羅番木瓜實生苗進行多重PCR性別鑒定，擴增結果（圖2）顯示：1、3、5、7號DNA樣品能擴增出225 bp條帶，說明所對應編號的4株番木瓜實生苗則為兩性株。2、4、6、8、9、10未擴增出DNA條帶，則為雌株。本實驗所選10株實生苗未測出雄株，‘蜜紅多重PCR性別鑒定結果與‘蔬羅基本相符。結合后期田間的實際植株生長發育的觀察情況，這種性別鑒定技術的準確率達98%以上，可用于實生苗幼齡期的兩性株鑒定。

2.2采用實生苗兩性株繁殖無根苗結果

這一階段的所需的培養基成分、培育程序與成齡側芽基本一致^[6-7]，主要由于番木瓜組織培養的基因依賴性較大，但從生長狀態上來看，實生苗莖尖培養比成齡側芽生長速度快，而且繁殖率相比較高。從方差分析結果來看，在0.05水平差異顯著。

2.3誘導實生兩性組培苗生根及其移栽結果

2.3.1??最佳生長調節劑的生根誘導結果??試驗結果顯示，以成齡側芽組培篩選出的最佳生長調節劑組合IBA 0.75 mg/L+NAA 0.05 mg/L+KT 0.01 mg/L配制的生根培養基對實生兩性組培苗的生根誘導效果更加明顯，每次試驗的催根率都要高于成齡側芽組培苗，其3次試驗的平均催根率達到81.1%，比成齡側芽組培苗66.7%高出約14.4%（表1），方差顯著性分析結果為差異顯著（P<0.05）。而且番木瓜實生苗來源的組培苗無論是生長周期還是長勢都比成齡側芽來源的組培苗好，多數木瓜苗在繼代2～3代后就能長到10 cm，且十分健壯，這在成齡側芽組培苗培養過程中比較少見。從不同番木瓜品種的‘蜜紅和‘蔬羅實生苗來源的組培苗在催根率上可以看到，‘蔬羅的催根率比‘蜜紅的催根率高21.1%（表2），表明不同的番木瓜品種在同一培養基質上產生差異明顯的結果，這進一步證明在番木瓜組培苗培育過程中存在著品種或基因依賴性問題，因此研究通用型的番木瓜組培苗培育規程，包括培養基質，對實際生產中大規模推廣應用番木瓜組培苗替代種子實生苗具有極其重要的現實意義^[2，8]。本研究利用幼態型外植體解決成齡側芽來源的番木瓜組培苗催根率和移栽成活率低的問題，至于通用型培養規程還有待于更深入的研究。

2.3.2 ?生根劑最佳濃度和浸泡時間作用下的移栽成活結果??利用誘導生根后的番木瓜實生兩性組培苗做移栽試驗。在成齡側芽組培苗試驗中篩選出的最佳濃度50 mg/L的生根劑里浸泡8 h的基礎上，在相同的實驗條件下，統計3次試驗的成活率分別為92.1%、91.7%、89.7%，其平均成活率達到91.1%，比成齡側芽組培苗87.5%的成活率稍顯高，且番木瓜苗生長速度很快，對環境的適應性則更強^[9-10]。方差顯著性分析結果為差異顯著（P<0.05）。以上試驗結果說明，采用同樣的試驗條件和方法，實生兩性組培苗對于生長調節劑和生根劑最佳濃度以及浸泡時間的應激性效果更好（表3）。可能原因是不同組織器官對于基因表達和應激能力不一樣^[11-12]。

同時在實驗過程中也發現，不同番木瓜品種（‘蔬羅‘蜜紅）兩性組培苗的最佳生根劑濃度和浸泡時間下的移栽成活率也不盡相同（表4），但差異不大，方差顯著性分析結果為不顯著（P>0.05）。從總體效果上看實生苗兩性株組培苗比成齡側芽組培苗優勢明顯，能滿足商業生產的水平。

2.4從成齡株植性狀上驗證多重PCR性別鑒定的結果

實生兩性組培苗經過田間移栽4個月后長大開花結果，從花型上觀察組培苗性別兩性株率為100%，這一結果表明本研究利用多重PCR技術鑒定的性別準確率達到100%，而且長勢良好，生長均一（圖3，圖4）。因此，利用多重PCR技術鑒定性別后進行兩性組培苗的研發的結果技術可靠性相當高，這為利用番木瓜種子實生苗作為外植體進行組培快繁提供了保證，同時也為其他作物組培快繁技術研發提供了技術參考。

3??討論

3.1避免在鑒定番木瓜實生苗兩性株性別時產生“假陽性”結果

在本研究的試驗過程中，對實生苗采用了PCR技術做性別鑒定時發現，利用何堯生等^[4]報道的多重PCR技術方法對番木瓜實生苗進行性別鑒定，結果出現極少量的性別“假陽性”——即雌株或兩性株被鑒定為雄性或既是雄株又是兩性株的情況，給鑒定的準確率帶來一定的不確定性。本研究用同樣的方法提取番木瓜總DNA，并以此作為模板采用單一PCR技術，同時調整PCR循環參數，鑒定結果發現準確率相當高，經分析推測產生這樣的結果可能是多重PCR在擴增過程中不同引物間相互作用或反應體系的復雜性造成的“假陽性”。因此，筆者采用單一PCR技術盡管在實驗步驟上會繁瑣一點，即把每個DNA模板按兩份分開加不同的引物，這能保證穩定準確的鑒定結果，對進一步開展實生苗組培種苗技術研發具有重要意義。

3.2需要對實生苗組織培養體系作進一步的優化和深入研究

由于番木瓜株性復雜，種子組培苗在初始培養的苗期無法保證株性一致，需要對株苗做性別鑒定，待篩選到具有商業化價值的兩性株時作為外植體進行組培研究，雖然這一技術較易獲得無菌材料，并且材料為幼態更易進行后續的增殖及誘導生根，但以此培育的組培種苗在性狀（如果型、品質、產量及抗病性等）上難以預測，這在一定程度上需要其他分子及生化證據的支持，因此除了對性別進行鑒定外，還應對各實生苗的遺傳性狀進行確定，包括果實的品質、抗病、耐寒、矮化、高產等，而這些性狀僅在植株生長到成熟階段才能確定，這需要在今后的工作中研究獲得相關的分子證據及佐證技術方法證實苗期的性狀。成齡側芽在組培過程中除了預備期外植體消毒難，以及老態化而導致低誘根率和低移栽成活率問題外，其培育的組培苗不僅與母體一樣的兩性株，而且具有明確的與母體一樣的優良性狀。這是采用成齡側芽進行組培種苗研發的最大優勢，也是目前利用種子實生苗進行組培苗快繁無法比擬的^[6]。因此番木瓜組培種苗生產上還是優先采用兩性成齡側芽開展的生產，而實生兩性組培苗則有待于開展幼苗期與品質、產量等相關的分子生物學基礎研究。筆者認為兩者可以結合一起運用于生產中，即利用實生兩性組培苗技術建立多個株系，通過田間比較篩選優良母株作為后期兩性成齡側芽組培苗培養的材料，這樣就有可能保證組培種苗在生長速度、遺傳穩定、植株質量等方面都能取得俱佳的效果。針對番木瓜組培苗的快速繁殖，應加強對實生兩性組培苗的基礎及技術研究，大力推廣組培苗的規模化生產，并通過政府、研究機構等渠道加強宣傳番木瓜組培種苗的優勢，讓更多生產商參與進來，加快推進番木瓜產業更快的發展，同時也堅信未來番木瓜常規的種子繁殖也會逐漸被組織培養所取代^[13-14]。

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