橡膠樹多主棒孢病菌Cassiicolin基因條形碼數據庫構建及分子檢測技術

李博勛 劉先寶 馮艷麗 解惠婷 黃貴修

摘 ?要??多主棒孢（Corynespora cassiicola）是為害我國主要熱帶作物的植物病原真菌，其寄主范圍廣、形態差異顯著、癥狀類型多樣，且含有一種寄主專化性毒素Cassiicolin，存在6種毒素類型。本研究利用已公布的Cassiicolin毒素基因（Cas1～Cas6型），構建了含287個菌株的國內橡膠樹和部分熱帶作物多主棒孢Cassiicolin基因條形碼數據庫，建立了一套特異性強、靈敏度高的分子檢測技術，可檢測100 pg/μL的目標基因組DNA，系統分析了我國橡膠樹、木薯、番木瓜、瓜菜等主要熱帶作物的919株多主棒孢的毒素類型，發現國內僅存在Cas2和Cas5這2種毒素類型，其中Cas5型的菌株占94.8%，為橡膠樹多主棒孢的優勢種群和特有毒素類型。而Cas2型是橡膠樹和其他作物多主棒孢共有的毒素型。系統發育分析發現，不同毒素類型的多主棒孢菌株與寄主來源密切相關，但與地理來源沒有明顯的相關性，且Cas5型多主棒孢具有明顯的寄主專化性。通過構建多主棒孢Cassiicolin基因條形碼數據庫，為明確我國主要熱帶作物多主棒孢病菌的種群結構和優勢種群情況，發掘、保存多主棒孢菌種資源以及制定病害的防治策略上具有重要的指導意義。

關鍵詞 ?多主棒孢;Cassiicolin毒素基因;DNA條形碼;分子檢測中圖分類號??S763.7??????文獻標識碼??A

Construction of Cassiicolin Genes Barcode Database and Molecular Detection Technology of Corynespora cassiicola?from Hevea brasiliensis?in China

LI Boxun， LIU Xianbao， FENG Yanli， XIE Huiting， HUANG Guixiu^*

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?Corynespora cassiicolais a plant pathogenic fungus， which is harmful to major tropical crops in China. It has a wide range of hosts， significant morphological differences， diverse symptoms and contains a host-specific toxin， which encoding up to six distinct protein isoforms. In the study， we used public database to construct Cassiicolin genes barcode database ofC. cassiicolaform major tropical crops in China.?At the same time， we established a set of molecular detection techniques with high specificity and sensitivity， which could detect 100 pg/μL target genomic DNA. Then， we systematically detected the isoforms cassiicolin ofC. cassiicola， which were isolated from rubber tree， cassava， papaya， melon and vegetable in China. There were only two isoforms Cassiicolin in China， among which the Cas5 isoform Cassiicolin accounted for 94.8%， and had obvious host specificity and was specific and advantage population on rubber tree in China. Phylogenetic tree analysis showed that distinct isoforms Cassiicolin ofC. cassiicolawas closely related to host origin， but not to geographical origin. The results of the research would significantly contribute to the population genetic structure， dominant population， preservation ofC. cassiicolaand control strategies.

Keywords ?Corynespora cassiicola; Cassiicolin genes; DNA barcoding; molecular detection

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.015

多主棒孢（Corynespora cassiicola）是一種重要的植物病原真菌，其寄主范圍十分廣泛，可侵染為害熱帶地區主要經濟作物（橡膠樹、木薯）、瓜菜、果樹和花卉等，生理小種復雜，侵染破壞力極強，病斑類型多樣，具有豐富的遺傳多種樣性^[1-4]。該菌含有特別的寄主專化性毒素Cassiicolin，是一種新型結構的毒素蛋白，這也是該菌最主要的致病因子，存在6種毒素類型^[5]。Atan等^[6]通過致病譜差異確定了橡膠樹多主棒孢可能存在2個生理小種，結合RAPD、rDNA-RFLP和ISSR標記可將2個生理小種在遺傳學方面進行有效區分，Shukor等^[7]推測，在橡膠樹上可能存在第3個生理小種，但至今仍未明確多主棒孢的生理小種。現有研究表明，多主棒孢的遺傳進化支與寄主來源密切相關，但與其形態特征、致病性、地理來源以及品種（系）之間沒有明顯的相關性。Déon等^[8]通過Cassiicolin毒素基因、ITS、ga4、caa5，以及act1基因序列對不同寄主植物和地理來源多主棒孢分離物的多樣性進行了分析，其中47%供試分離物中檢測到Cassiicolin編碼基因，可編碼6種不同類型的蛋白質，通過定義的Cassiicolin毒素類型使聚類分析結果更加清晰明了。劉先寶等^[9]分析了國內橡膠樹多主棒孢Cassiicolin毒素的多樣性與致病力分化之間的關系，初步獲得了橡膠樹上多主棒孢的主要毒素類型。因此，在多主棒孢的生理小種尚未確定的情況下，國際上常利用Cassiicolin基因編碼的6個毒素類型，來進一步劃分多主棒孢病菌的致病型，這也是現階段研究多主棒孢分類的主要依據。

多主棒孢在我國分布較廣，為害的作物種類多，研究價值大。而傳統的鑒定方法常根據寄主、病斑類型、病原菌的形態特征、培養性狀等進行區分，而多主棒孢病菌造成的病斑類型多樣，病原菌極容易變異，而且不同類型的多主棒孢菌株的形態特征和培養性狀上存在一定的差異。而Cassiicolin毒素基因是多主棒孢基因組中一段公認的、特有的、相對較短的DNA序列，能將多主棒孢與其他真菌進行有效區分、精準鑒定。為此，本研究擬構建多主棒孢Cassiicolin基因條形碼數據庫，利用該數據庫對國內主要熱帶作物多主棒孢菌株進行鑒定，明確病原菌的遺傳結構和優勢種群，建立多主棒孢病菌的早期分子檢測技術。這對明確我國主要熱帶作物多主棒孢的種類組成，系統發育與寄主的多樣性關系，發掘、保存多主棒孢菌種資源以及制定病害的防治策略上具有重要意義。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?供試菌株??287株多主棒孢菌株（表1）以及用于分子檢測的其他病原菌菌株均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所熱帶工業原料作物病害研究組分離和保存，其中橡膠多主棒孢275株，其他寄主多主棒孢12株。NCBI數據庫下載的多主棒孢Cassiicolin基因信息（表2）。

1.1.2??培養基與試劑??PDA培養基參照《植病研究方法》配制^[10]，用于多主棒孢菌株的培養。引物（表3）均由華大基因股份有限公司合成;克隆載體pMD18-T、PCR擴增反應試劑購于TAKARA公司;pMD18-T載體、TaqDNA聚合酶、dNTP等購自寶生物工程（大連）有限公司。DNA Maker、Trans5α大腸桿菌感受態購自北京全式金生物技術有限公司。其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 ?儀器與設備??Bio-Rad T100型梯度PCR儀，美國伯樂公司; UVI FireReader凝膠成像系統，英國UVItec公司。

1.2方法

1.2.1??DNA提取、PCR擴增和測序??采用CTAB方法^[11]提取病原菌DNA，用超微量分光光度計進行DNA質量測定，用Cassiicolin引物序列（表3）對病原菌目的基因進行PCR擴增，反應條件參照Déon等^[5]的方法，擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，經Omega Bio-Tek試劑盒進行目的條帶回收之后克隆到pMD18-T載體，轉化Trans5a大腸桿菌感受態細胞。篩選陽性克隆轉化子，送華大基因技術有限公司進行序列測定。

1.2.2 ?序列分析、遺傳距離計算和系統發育樹構建??將序列在NCBI中進行BLAST分析，利用CodonCode Aligner V7.0.1去除測序峰圖的低質量區域、完成峰圖校對拼接和引物序列切除，應用PUAP 4.0軟件計算種內、種間遺傳距離;利用MEGA7.0軟件最大似然法中的Tamura-Nei model構建系統發育樹。

1.2.3??分子檢測技術??用Cassiicolin引物對供試菌株的DNA進行特異性檢測，通過優化反應體系中各試劑用量及退火溫度，建立PCR擴增最佳反應條件：反應體系加入量DNA（50 ng/μL）1 μL，特異引物對（10 pmol/μL）1 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq酶0.3 μL，ddH₂O 18.2 μL。PCR擴增程序為：94?℃預變性3 min，94?℃變性45 s，57?℃退火45 s，72?℃延伸1 min，35個循環，72?℃延伸完全10 min，4?℃下保存。將供試菌株的DNA濃度分別稀釋為30 ng/μL、20?ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL和1 pg/μL，按照上述反應條件和程序進行PCR擴增，以ddH₂O作為陰性對照。

2??結果與分析

2.1多主棒孢Cassiicolin基因條形碼數據庫的構建

根據菌株地理來源、寄主、年份和毒素類型等信息，挑選了287株代表性菌的Cassiicolin基因序列上傳至NCBI數據庫，構建了國內主要熱帶作物多株棒孢的Cassiicolin條形碼數據庫（表1）。基于NCBI公共數據庫已公布的多主棒孢Cassiicolin基因信息，分別使用BLAST方法和MJ系統發育樹法與NCBI數據庫已公布的多主棒孢Cassiicolin條形碼序列進行比對，共同構建系統發育樹（圖1）。結果發現，供試的多主棒孢菌株與NCBI已公布的多主棒孢Cassiicolin序列同源性均高達99%，第Ⅰ大類群是Cas5型，均為橡膠樹多主棒孢，主要來源于云南、海南、廣東、廣西等國內橡膠主產區，還有部分菌株來源于越南、柬埔寨、馬來西亞。第Ⅱ大類群是Cas2型，是橡膠和其他作物均有的多主棒孢，主要來源于橡膠樹、木薯、黃瓜、番木瓜、大豆、棉花等，不同寄主上的菌株親緣關系近，都聚類到一個分支上。從系統發育樹的結果可以看出，不同毒素類型的多主棒孢菌株與寄主來源密切相關，但與地理來源沒有明顯的相關性，且Cas5型的多主棒孢僅為橡膠樹所特有，為我國橡膠樹多主棒孢的優勢種群。

2.2Cassiicolin毒素基因的分子檢測

本研究對我國橡膠主產區以及主要熱帶作物上分離保存的919株多主棒孢病菌進行Cassiicolin毒素基因檢測。發現我國多主棒孢病菌僅存在2種毒素類型，分別是Cas5型和Cas2型，其中Cas5型的菌株占94.8%，為國內橡膠樹主產區多主棒孢病菌的優勢種群，且為橡膠樹所特有。而Cas2型是橡膠樹和其他作物（如：番木瓜、木薯、黃瓜等）多主棒孢共有的毒素類型，占3.2%。另一部分菌株未檢測到Cassiicolin毒素基因，定為Cas0型，占2%，在供試菌株中均未檢測到Cas1、Cas3、Cas4和Cas6型毒素基因的菌株（圖2）。

用Cassiicolin（Cas5/Cas2）引物進行特異性檢測，分別對殼梭孢（HNrMLXY1601）、茄類鐮刀菌（FsHHNBS04）、尖孢鐮刀菌（Foc4）、膠孢炭疽菌（Hbcg01）、尖孢炭疽菌（YN26-2）進行分子檢測。從圖3和圖4的擴增檢測結果可以看出，Cas5-F/Cas5-R和Cas2-F/Cas2-R特異引物對僅能從供試多主棒孢菌株中擴增到目的條帶，約750 bp，其他對照菌株和陰性對照均無任何擴增產物，并且Cas5-F/Cas5-R引物僅能擴增得到多主棒孢Cas5型毒素基因，Cas2-F/Cas2-R引物亦如此，具有唯一性說明這兩對引物對多主棒孢菌株有較強的特異性，可以用于多主棒孢病菌的分子檢測（圖3，圖4）。

用Cas5-F/Cas5-R和Cas2-F/Cas2-R進行引物的靈敏度檢測，分別對Cas5型菌株HCcYN49和Cas2型菌株PaCcSD02進行梯度擴增，使其DNA濃度為30 ng/μL、20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL和1 pg/μL時進行擴增，并設置陰性對照。擴增結果顯示，

30?ng/μL～100 pg/μL濃度的多主棒孢病菌DNA均可擴增到約750 bp的特征條帶，對照物無擴增條帶，Cas5-F/Cas5-R和Cas2-F/Cas2-R均可以檢測到100 pg/μL及以上濃度的目標基因組DNA，可用于多主棒孢病菌的快速檢測（圖5）。

左圖為特異引物Cas5-F/Cas5-R的擴增結果，右圖為特異引物Cas2-F/Cas2-R的擴增結果。

The left?picture is the amplification result of the specific primer Cas5-F/Cas5-R and the right one is the amplification result of the specific primer Cas2-F/Cas2-R.

1：30 ng/μL;2：20 ng/μL;3：10 ng/μL;4：5 ng/μL5：1 ng/μL;6：100 pg/μL;7：10 pg/μL;8：1 pg/μL;9：陰性對照（negative control）;M：DL2000 DNA marker。

3??討論

DNA條形碼是生物基因組中普遍存在的、較短的、標準化的DNA序列，它具有穩定的種內保守性，又包含足夠的種間遺傳變異，實現了對物種的快速而準確的鑒定^[12]。相比于傳統的形態學鑒定，DNA條形碼技術不受個體發育階段、完整性等方面的影響，可以一次性快速鑒定大量的樣本，極大的促進了生物分類學、生物多樣性以及分子系統學等領域的研究^[13]。Cassiicolin毒素基因是多主棒孢基因組中一段公認的、特有的、相對較短的DNA序列，能將多主棒孢與其他真菌進行有效區分，實現精準鑒定。在多主棒孢生理小種尚未定論的情況下，國際上常利用Cassiicolin基因編碼的6個毒素類型作為多主棒孢種內和種間遺傳結構、種群變化以及致病類型的主要依據^[14]。本研究基于Cassiicolin基因，構建了含287個菌株的國內主要熱帶作物多主棒孢基因條形碼數據庫，建立了多主棒孢早期分子檢測技術，分析了919株多主棒孢的毒素類型，發現我國多主棒孢病菌僅存在2種毒素類型，分別是Cas5型和Cas2型，其中Cas5型為國內橡膠樹主產區多主棒孢病菌的優勢種群，且為橡膠樹所特有，而Cas2型是橡膠樹和其他作物（如：番木瓜、木薯、黃瓜等）多主棒孢共有的毒素類型。在供試的多主棒孢菌株中均未檢測到Cas1、Cas3、Cas4和Cas6型毒素基因的菌株。據Déon等^[5]研究發現，Cas1型菌株主要是非洲國家橡膠樹和其他作物共有;Cas2和Cas6型菌株來源于國外其他寄主植物（非橡膠）;Cas3和Cas4型均來自巴西的橡膠樹內生多主棒孢菌株;Cas5型菌株則來源于中國、馬來西亞、柬埔寨、斯里蘭卡等亞洲國家橡膠樹。盡管Cas5型為我國橡膠多主棒孢的優勢種群，但Cas2型只有在我國的橡膠樹上發現，其他國家的Cas2型只有在非橡膠的其他寄主植物多主棒孢上存在。目前，有關多主棒孢Cassiicolin毒素類型與致病性之間的關系尚未得到廣泛的研究，尤其是毒素類型與寄主專化性、致病力強弱、生物學特性、形態學以及癥狀類型之間的關系值得在今后的研究中深入開展。另外，在多主棒孢生理小種尚未明確的情況下，Cassiicolin毒素基因有助于對多主棒孢潛在的種內或種間遺傳進化關系的解析，特別是那些還沒有確認Cassiicolin毒素類型的Cas0型菌株，可能是多主棒孢新的種群。

DNA條形碼分析方法有5種^[12]，本研究采用了系統發育樹的分析方法，構建了多主棒孢基因條形碼序列的系統發育樹，在系統發育樹上形成了2個大的遺傳類群，分別是Cas5類群和Cas2類群，與分子檢測結果一一對應，各分枝與毒素類型相一致。系統發育樹的DNA條形碼分析法在一定程度上反映了物種的親緣關系，但由于不完全譜系分類、祖先多態性及物種旁系同源性等原因，某些物種在系統發育樹上不能形成單系，但本研究構建的多主棒孢Cassiicolin基因的系統發育樹沒有出現由于種內遺傳距離小，在系統發育樹上常形成嵌套關系的現象。而且相比于其他幾種DNA條形碼的分析方法，系統發育樹法擺脫了遺傳距離閾值等影響，只考慮序列內部的特征核苷酸，不涉及系統發育關系，在近緣種的鑒定上也表現出一定的優勢。通過系統發育樹進一步分析發現橡膠多主棒孢單獨成為一個類群，與其他寄主的多主棒孢菌株存在明顯的差異，但不同地理來源的菌株間無明顯差異。致病力分化分析顯示^[9]，橡膠多主棒孢菌株不能侵染其他寄主，存在明顯的寄主專化性現象，由于多主棒孢病菌寄主范圍廣，不同毒素類型結構上的差異導致病原菌在致病性和寄主專化性上存在明顯差異。

綜上所述，本研究首次構建了國內主要熱帶作物多主棒孢Cassiicolin基因條形碼數據庫，建立了基于Cassiicolin基因的多主棒孢早期分子檢測技術，系統分析了我國橡膠樹、木薯、番木瓜、瓜菜等主要熱帶作物多主棒孢的毒素類型，明確了國內多主棒孢的種群結構、優勢種群和特有毒素類型。本研究為明確我國主要熱帶作物多主棒孢病菌的種群遺傳結構和優勢種群情況，發掘、保存多主棒孢菌種資源以及制定病害的防治策略上具有重要意義。

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