延齡草總皂苷調控IL-6/STAT3信號抑制胃癌細胞侵襲和遷移的作用研究

張 剛 余 瓊 杜 娟

(江漢大學附屬醫院武漢市第六醫院消化內科,武漢430015)

胃癌是發生于消化系統的惡性腫瘤，其在世界范圍內影響著人類的生命健康，胃癌具有轉移快、早期發病隱匿等特點，多數患者在發現時已經處于胃癌晚期且已經發生了轉移，胃癌轉移是胃癌致死的重要原因之一[1]。延齡草屬于百合科植物，是傳統中藥之一，具有延年益壽、祛風活血等作用[2]。最近的研究表明，延齡草總皂苷具有抗腫瘤作用，目前在宮頸癌、結直腸癌等腫瘤細胞中已經驗證其具有體外抑制腫瘤細胞生長和轉移的作用，延齡草總皂苷對胃癌細胞侵襲和遷移作用尚不明確[3,4]。IL-6/STAT3信號是與腫瘤轉移有關的調節因子，IL-6表達上調可以誘導STAT3發生磷酸化，促進腫瘤細胞侵襲、遷移和EMT[5]。我們的實驗以明確延齡草總皂苷對胃癌細胞侵襲遷移的作用和機制為目的，為延齡草總皂苷治療腫瘤的臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1材料 胃癌細胞SGC-7901購自美國ATCC；MMP-2抗體、STAT3抗體、MMP-9抗體購自美國Sigma；延齡草總皂苷由湖北大學中藥生物技術實驗室提取保存；E-cadherin抗體、IL-6抗體購自美國Abcam；Vimentin抗體、p-STAT3抗體購自美國R&D Systems；IL-6重組慢病毒和陰性對照慢病毒由上海吉凱基因化學技術有限公司構建。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測延齡草總皂苷對胃癌細胞增殖影響 胃癌細胞經過計數之后按照3 000個/孔接種到96孔板內，將細胞按照0、10、20、40、80、160 mg/L的延齡草總皂苷作用濃度梯度分組，放在培養箱內孵育48 h，取出培養板，添加CCK-8溶液10 μl，在避光中反應2 h。測定酶標儀波長470 nm 的A值。

1.2.2Transwell小室檢測延齡草總皂苷對胃癌細胞侵襲和遷移影響 在Transwell小室中添加50 mg/L 的基質膠濕化，置于4℃風干，再添加不含血清的細胞培養液把基底膜水化0.5 h。將小室置于培養板內，分別在上室內加入100 μl的以不含血清且含有延齡草總皂苷濃度為0、10、20 mg/L的細胞培養液懸浮的胃癌細胞，同時分別在下室內加入500 μl含有血清的細胞培養液。繼續培養48 h，取棉簽把沒有穿膜的細胞清除掉，把Transwell小室取出后風干，以0.1%的結晶紫溶液染色30 min，添加PBS洗滌，分別選取5個視野，計算細胞侵襲數目。細胞遷移實驗前不用基質膠濕化小室，其余步驟同侵襲實驗。

1.2.3Western blot檢測延齡草總皂苷對胃癌細胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin、IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表達影響 取0、10、20 mg/L的延齡草總皂苷處理培養48 h后的胃癌細胞，提取細胞中總蛋白。按照下述方法進行Western blot檢測：依照BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度，分別吸取蛋白樣品加入到5×Loading Buffer溶液中混合(體積比為4∶1)。將電泳液添加到電泳槽內，以10%的分離膠進行SDS-PAGE凝膠電泳，每個泳道內蛋白上樣量為30 μg，Marker上樣量為5 μl，設置80 V的電壓進行電泳30 min，再調整電壓到120 V繼續電泳，直至溴酚藍染料到達底部之后方可停止電泳。常規半干法轉膜，轉膜參數為：120 mA，1.5 h。取出NC膜，置于5%牛血清白蛋白封閉液中孵育結合1.5 h。把NC膜取出，再放置于含有一抗的反應液內，在4℃過夜，NC膜與二抗(1∶2 000稀釋)反應液在室溫中孵育1.5 h，按照ECL發光試劑盒發光，用Quantity One分析各蛋白條帶的灰度值，GAPDH作為參照。

1.2.4IL-6慢病毒感染對延齡草總皂苷抗胃癌細胞侵襲、遷移和EMT影響 胃癌細胞按照常規方法感染IL-6重組慢病毒和陰性對照慢病毒，MOI=10，感染后24 h換液，繼續培養3 d感染效率高于90%，收集細胞用于后續實驗。感染IL-6重組慢病毒和陰性對照慢病毒的胃癌細胞用含有10 mg/L的延齡草總皂苷的細胞培養液培養，記為TST+Lv-IL-6組和TST+Lv-NC組，按照Transwell小室方法檢測細胞侵襲和遷移能力，按照Western blot方法檢測細胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin、IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平，步驟同上。

2 結果

2.1延齡草總皂苷抑制胃癌細胞增殖 見表1，20、40、80、160 mg/L的延齡草總皂苷處理后的胃癌細胞增殖能力降低，10 mg/L的延齡草總皂苷對胃癌細胞增殖沒有影響。為了消除細胞增殖對胃癌細胞增殖能力的影響，選用10 mg/L和20 mg/L的延齡草總皂苷做后續實驗。

2.2延齡草總皂苷對胃癌細胞侵襲和遷移影響 見圖1和表2，延齡草總皂苷處理后的胃癌細胞細胞侵襲和遷移數目均降低，細胞中侵襲遷移相關蛋白MMP-9和MMP-2表達水平均降低。延齡草總皂苷能夠體外抑制胃癌細胞侵襲及遷移。

Total saponins oftrillium concentration(mg/L)A57000.76±0.07100.69±0.05200.56±0.041)400.39±0.031)800.27±0.021)1600.20±0.021)F87.303P0.000

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

2.3延齡草總皂苷對胃癌細胞中EMT標志蛋白E-cadherin、Vimentin表達影響 見圖2和表3，延齡草總皂苷處理后的胃癌細胞細胞中E-cadherin蛋白表達水平升高，Vimentin蛋白表達水平降低。延齡草總皂苷能夠體外抑制胃癌細胞EMT。

圖1 Western blot檢測延齡草總皂苷對胃癌細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達影響Fig.1 Western blot to detect effect of total saponins of trillium on expression of MMP-2 and MMP-9 in gastric cancer cells

Total saponinsof trilliumconcentrationNumberof invasionNumberof migrationMMP-2MMP-90 mg/L105.65±10.69 156.32±13.580.63±0.060.66±0.0710 mg/L80.84±7.121)122.83±10.451)0.46±0.041)0.53±0.051)20 mg/L63.87±6.831)99.21±10.761)0.25±0.031)0.28±0.041)F18.77718.10453.45937.300P0.0000.0030.0000.000

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

圖2 Western blot檢測延齡草總皂苷對胃癌細胞中E-cadherin、Vimentin蛋白表達影響Fig.2 Western blot analysis of effect of total saponins of trillium on expression of E-cadherin and Vimentin in gastric cancer cells

2.4延齡草總皂苷對胃癌細胞中IL-6/STAT3信號關鍵蛋白IL-6、STAT3、p-STAT3表達影響 見圖3和表4，延齡草總皂苷處理后的胃癌細胞細胞中IL-6、p-STAT3蛋白表達水平降低。延齡草總皂苷能夠體外抑制胃癌細胞中IL-6/STAT3信號激活。

2.5IL-6過表達慢病毒提高延齡草總皂苷作用條件下胃癌細胞中IL-6/STAT3信號通路激活水平 見圖4和表5，IL-6過表達慢病毒感染后的胃癌細胞經過延齡草總皂苷處理后，細胞中IL-6、p-STAT3蛋白表達水平升高。IL-6過表達慢病毒提高延齡草總皂苷條件下胃癌細胞中IL-6/STAT3信號激活水平。

Total saponins of trilliumconcentrationE-cadherinVimentin0 mg/L0.34±0.030.73±0.0910 mg/L0.53±0.061)0.42±0.041)20 mg/L0.68±0.081)0.30±0.031)F23.97341.802P0.0010.000

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

圖3 Western blot檢測延齡草總皂苷對胃癌細胞中IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表達影響Fig.3 Western blot analysis of effect of total saponins of trillium on expression of IL-6,STAT3 and p-STAT3 in gastric cancer cells

2.6過表達IL-6逆轉延齡草總皂苷對胃癌細胞侵襲遷移和EMT影響 見圖5和表6，IL-6過表達慢病毒感染后的胃癌細胞經過延齡草總皂苷處理后，細胞侵襲遷移能力升高，MMP-9、MMP-2和Vimentin蛋白水平升高，E-cadherin蛋白水平降低。過表達IL-6能夠逆轉延齡草總皂苷對胃癌細胞侵襲遷移和EMT的抑制作用。

Total saponins of trilliumconcentrationIL-6STAT3p-STAT30 mg/L0.86±0.080.70±0.070.58±0.0610 mg/L0.52±0.051)0.71±0.060.39±0.031)20 mg/L0.34±0.041)0.70±0.080.32±0.021)F59.7710.02033.245P0.0000.9800.001

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

圖4 Western blot檢測IL-6過表達慢病毒載體對延齡草總皂苷影響胃癌細胞中IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表達作用Fig.4 Western blot analysis of effect of lentiviral vector over-expressing IL-6 on expression of IL-6,STAT3 and p-STAT3 in gastric cancer cells with total saponins of trilliumNote: 1.TST+Lv-Nc group;2.TST+Lv-IL-6 group.

GroupsIL-6STAT3p-STAT3TST+Lv-NC group0.43±0.040.79±0.080.36±0.03TST+Lv-IL-6 group0.64±0.031)0.80±0.070.54±0.051)t7.2750.163 5.347P0.0020.879 0.006

Note：Compared with TST+Lv-NC,1)P<0.05.

圖5 Western blot檢測過表達IL-6對延齡草總皂苷影響胃癌細胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin蛋白表達作用Fig.5 Western blot analysis of effect of IL-6 overexpress-ion on expression of MMP-2,MMP-9,E-cadherin and Vimentin in gastric cancer cells with total saponins of trilliumNote: 1.TST+Lv-Nc group;2.TST+Lv-IL-6 group.

圖6 過表達IL-6后經延齡草總皂苷處理的胃癌細胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平和細胞侵襲(A)、遷移(B)數目Fig.6 Expression levels of MMP-2,MMP-9,E-cadherin,Vimentin and number of cell invasion (A) and migration (B) in gastric cancer cells treated with total saponins of trillium after overexpression of IL-6

GroupsNumber of invasion Number of migrationMMP-2MMP-9E-cadherinVimentinTST+Lv-NC group83.65±9.15120.17±11.320.54±0.050.57±0.060.77±0.050.56±0.04TST+Lv-IL-6 group 110.68±11.521)147.25±9.831)0.96±0.101)0.76±0.051)0.50±0.041)0.83±0.081)t3.1823.1296.5074.2147.3045.229P0.0340.0350.0030.0140.0020.006

Note：Compared with TST+Lv-NC,1)P<0.05.

3 討論

我們發現，延齡草總皂苷處理后的胃癌細胞的增殖能力降低，細胞侵襲和遷移能力下降，說明延齡草總皂苷具有抗胃癌細胞體外惡性表型的作用，延齡草總皂苷可能是胃癌治療的有效方法。延齡草屬于多年生草本植物，含有黃酮苷、甾體皂苷等多種化學成分，具有解毒、止血等功效，常用于治療高血壓、跌打損傷、頭暈目眩等癥狀[6,7]。近年來的研究報道顯示，延齡草還具有凝血、消炎等活性，對于腫瘤具有抑制作用[8]。延齡草總皂苷是提取自中藥延齡草中的活性成分，對于肺癌、乳腺癌等腫瘤細胞具有體外抗生長和抑制轉移的作用，延齡草總皂苷處理后的乳腺癌細胞侵襲和遷移能力降低，細胞中侵襲和遷移蛋白MMP-9、MMP-2表達水平降低，延齡草總皂苷可能是腫瘤治療的有效藥物之一[9-11]。我們的實驗結果與上述研究報道一致，說明延齡草總皂苷對胃癌細胞的抑制作用與其余腫瘤相同，均具有抑制細胞轉移潛能的作用。

本次實驗還檢測了延齡草總皂苷處理后的胃癌細胞中EMT相關蛋白表達情況，發現延齡草總皂苷可以抑制間質蛋白Vimentin的表達并促進上皮蛋白E-cadherin的表達，延齡草總皂苷具有抗胃癌細胞EMT的作用。腫瘤細胞EMT與腫瘤的惡性轉移呈正相關，并且腫瘤細胞EMT是腫瘤轉移的早期標志，EMT的特點為間質標志物表達上調而上皮標志物表達下調[12-16]。我們的實驗證實了延齡草總皂苷具有抗胃癌細胞EMT的作用，這為研究延齡草總皂苷抗腫瘤機制提供了新思路。

IL-6/STAT3是與腫瘤有關的信號轉導通路，IL-6具有多種生物學功能，其可以由腫瘤細胞等多種細胞產生，通過激活STAT3磷酸化而發揮腫瘤誘導作用[17,18]。在卵巢癌、胃癌、結直腸癌等大多數腫瘤組織中發現，阻斷IL-6/STAT3信號轉導可以抑制腫瘤細胞的惡性表型，其也是目前腫瘤治療的有效靶點之一[19-21]。我們的實驗結果表明，延齡草總皂苷處理后的胃癌細胞中IL-6蛋白和STAT3磷酸化水平降低，并且通過上調IL-6表達水平激活IL-6/STAT3信號通路可以逆轉延齡草總皂苷抗胃癌細胞侵襲遷移和EMT的作用，這說明延齡草總皂苷可以通過抑制IL-6/STAT3信號激活發揮抗胃癌作用。

總而言之，本次實驗初步明確了延齡草總皂苷對胃癌細胞的作用和機制，對于不同來源的延齡草總皂苷的敏感性及具體的機制還需要在以后的實驗中進行探討。延齡草總皂苷可能是胃癌治療的有效途徑，并且其作用機制與下調IL-6/STAT3信號激活水平有關，這對于研究延齡草總皂苷抗腫瘤機制具有重要意義。本次實驗只在體外進行了初步探討，后續還需要在體內和多方面進行研究和驗證。