麝香酮處理后CIRI模型大鼠海馬組織中S100β、NF-κB表達變化研究*

肖珍科，黎賢泰，王 保，堯新華，張立賢

1.廣州市中醫醫院麻醉科(廣州 510130)；2.廣州市紅十字會醫院麻醉科(廣州 510220)

麝香是許多名貴特效急救中成藥如安宮牛黃丸、局方至寶丹等發揮藥效所不可或缺的主要藥味，它具有開竅、醒神、活血通絡、消腫止痛的功效，主治熱病神昏、中風痰厥等證，麝香酮是天然麝香的主要有效成分。目前的研究表明，麝香酮對腦損傷有明確療效，本研究設計對大鼠CIRI模型腹腔灌注麝香酮，檢測灌注前后大鼠測定海馬組織中S100β、NF-κB p65 活性值的變化，觀察麝香酮對CIRI的干預效果。

資料和方法

1 一般資料

1.1 實驗動物及分組：采用健康SD老年大鼠60只(廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(粵)20130034)。隨機分為缺血再灌注組(CIRI)，麝香酮組(SXT)和生理鹽水對照組(CON)。CIRI即腦缺血再灌注損傷模型組，大鼠腹腔內注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，麻醉后于大鼠頸部正中切口，分離雙側頸總動脈和迷走神經，用小動脈夾夾閉雙側頸總動脈20 min后打開動脈夾，再灌注2 h，斷頭處死大鼠。SXT即麝香酮組，提前2 h對SD老年大鼠腹腔注射麝香酮溶液(3.6 mg/kg)，每小時注射一次，后造CIRI大鼠模型。CON表示SD老年大鼠灌胃給予生理鹽水，其余操作同SXT。處死大鼠后取海馬區腦組織，采用凝膠電泳遷移分析法測定海馬組織中S100β、NF-κB p65活性值。實驗分兩次完成，每次完成30只大鼠實驗。

1.2 實驗儀器：垂直電泳儀及轉移系統(BIO RAD)、射線攝影暗匣(5X7英寸富士X光片發光暗盒，廣州藝佳生物)、脫色搖床(Rotomix公司)等。

1.3 實驗試劑：蛋白提取液(碧云天生物)、十二羥硫酸鈉(SDS)(廣州威佳)、二硫蘇糖醇(DTT)(Sigma)、甘油(國產)、丙烯酰胺(Sigma)、N，N-亞甲基丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)(Sigma)、四甲基乙二胺(TEMED)(上海生工)、過硫酸銨(AP)(廣州化學試劑廠)、甘氨酸(鼎國)、Tris堿(Sigma)、甲醇(廣州化學試劑廠)、Tween-20(Sigma)、脫脂奶粉(伊利)、PVDF膜(BIO RAD)、一抗S100β(ABCAM，AB52642，1：4000)、一抗NF-κB(ABCAM，AB16502，1：2000)、羊抗兔IgG/HRP(BA1055博士德)、羊抗小鼠IgG/HRP(BA1051博士德)、β-actin(3700 CST)。

2 實驗方法與步驟

2.1 溶液的配制：①30%丙烯酰胺 100 ml。②1.5 mol/L pH8.8Tris-HCL 100 ml。③1.0 mol/L pH6.8Tris-HCL 100 ml。④10%SDS 100 ml。⑤10%過硫酸銨100 ml。⑥TEMED購自成品。⑦2 X SDS凝膠加樣緩沖液。⑧1 mol/L DTTl。⑨脫色液 100 ml。⑩Tris-甘氨酸電泳緩沖液 1000 ml；染色液180ml。

2.2 凝膠的配制 一般配制凝膠濃度為12%。先配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠，加入TEMED后，再配制成濃縮膠。

2.3 樣品的前處理：裂解后的樣品離心后進行BCA蛋白定量測定。

2.4 免疫印跡：上樣與電泳，轉膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，發光顯影，得到顯影條帶。

3 觀察項目 記錄每組所顯影的條帶，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。

結 果

麝香酮能降低CIRI大鼠海馬區腦組織的S100β、NF-κB p65活性值，與空白組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠海馬區腦組織的S100β、NF-κB p65含量比較

注：與空白組比較，◇P<0.01；與對照組比較，◆P<0. 05

討 論

S100β蛋白是構成神經膠質細胞胞液的主要成份，當腦損傷尚處于無癥狀的亞臨床狀態時，結構上受損的神經膠質細胞會釋出S100β進入腦脊液。這說明在對腦損傷的檢測中，S100β有較高的特異性[1-3]。核轉錄因子NF-κB (NF-κB) 是普遍存在于真核細胞中的一種轉錄因子，具有多向轉錄調節作用，1986 年首先發現它是 B 淋巴細胞中免疫球蛋白 κ輕鏈轉錄所需的核轉錄因子，故命名 NF-κB[4]。NF-κB參與多種細胞因子和炎癥介質的轉錄調節。腦缺血再灌注可導致NF-κB的激活在許多研究中都已得到證實。NF-κB 表達部位與缺血時間有關[5-6]。而敲除P65基因的小鼠在同樣條件下的缺血性腦損傷明顯減輕，說明NF-κB 在腦缺血中具有促進細胞損傷的作用[7]。近年來，NF-κB 的活化被認為是介導和加劇 CIRI的重要環節，并開始初步探討阻斷NF-κB 激活過程保護腦組織[8]。正常情況下，在大腦皮層和海馬區域，NF-κB與其抑制蛋白 IκB 結合，處于低水平狀態。腦缺血再灌注后，氧化應激的產生導致白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α 等細胞因子增多，通過與靶細胞表面的特異性受體結合，引起信號在胞質內的釋放和傳導[9]，最終導致 IκB 在 IκB 激酶( IκB ki-nase，IKK) 的作用下發生磷酸化而降解，與 NF-κB解離，游離NF-κB p65 迅速由細胞質移位到細胞核，與多種基因的啟動子部位 κB 位點結合，轉錄調節多種細胞因子和炎癥介質、黏附分子、生長因子等[10]。通過抑制 CIRI 大鼠NF-κB 的表達，或者降低局灶性 CIRI 大鼠NF-κB p65的活化，調控NF-κB p65 信號通路上的關鍵信號分子，從而改善大腦缺血所致的神經元凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷[11-13]。

麝香酮(3-甲基環十五烷酮)是人工麝香中的主要活性成份，具有抗癡呆、抗腦缺血、抗炎等多方面藥理作用。研究證明麝香酮對神經母細胞瘤細胞缺氧缺糖和再給氧損傷具有顯著的保護作用，提示麝香酮有可能用于中風病急性期的治療[14]；它能明顯縮小腦缺血再灌注損傷模型大鼠的腦梗塞體積，減輕腦缺血再灌注所引起的神經細胞損傷，其作用機制主要為[15-19]：增加大腦組織SOD含量，降低MDA含量，減輕缺血、缺氧造成的興奮性氨基酸含量，抑制興奮性氨基酸導致的興奮性神經毒性；抑制谷氨酸通過N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體介導的神經元內 Ca2+超載，降低乳酸脫氫酶(LDH)釋放，穩定細胞線粒體膜電位；減少谷氨酸轉運體EAAC1 逆向轉運，減輕興奮毒性，抑制氧化損傷，減少EEACl mRNA 表達，抑制NMDA受體的激活，抑制 Ca2+-Ca MKII和ASK-1/JNK/p38 信號通路，調節B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族的表達等；還可以通過刺激交感神經興奮，使腦動脈中的β受體興奮，腦血管緊張度降低，彈性改善，血管擴張，促使腦血流量增加，使腦組織氧含量和能量代謝等得到充分改善，從而保護腦缺血后神經元的損傷。另外，大鼠局灶性腦缺血損傷模型大鼠給予麝香酮后，能減輕缺血、缺氧造成的血腦屏障通透性改變，減少蛋白質漏出，從根本上降低腦細胞的水腫程度，并對海馬CA3區神經元凋亡發生影響，防止腦缺血病程發展，從而發揮對腦缺血保護作用[20-21]。

本次實驗結果SXT與CIRI比較，S100β及NF-κB p65蛋白相對灰度明顯下降，表明麝香酮能明顯降低CIRI模型大鼠的S100β和NF-κB p65值，提示麝香酮抗CIRI的作用與減少S100β蛋白釋放，減少NF-κB蛋白表達，減輕興奮性氨基酸毒性有關，說明麝香酮腹腔內灌注對POCD可能有一定的預防效果。

SXT與CON比較，S100β的變化有明顯差別，而NF-κB p65的變化無明顯差別，提示中藥方劑的起效方式較復雜，其中單味藥材有效成分所起的作用有限，還需要做進一步研究。