一氧化氮清除劑Carboxy-PTIO對短暫性局灶性腦缺血大鼠PERK/p-eIF2α通路的調節作用

黃語悠 房亞蘭 師文娟 劉克建 趙詠梅 丁 錨 羅玉敏

(首都醫科大學宣武醫院中心實驗室 北京市老年病醫療研究中心 神經變性病教育部重點實驗室 腦血管病轉化醫學北京市重點實驗室，北京 100053)

缺血性腦血管病是導致死亡的重要原因之一，也可導致不同程度的認知障礙和肢體殘疾。腦缺血通過一系列復雜的病理過程導致腦損傷，但具體機制目前仍不明確。其中，氧化應激損傷被認為是腦缺血再灌注損傷過程中重要的一環，是導致缺血后一系列病理反應發生的中心環節，故而氧化應激損傷一直是缺血性卒中研究的重點對象。

一氧化氮( nitric oxide, NO)是神經系統內的一種小分子神經遞質，并且在神經網絡的突觸可塑性和活性依賴性修飾中起重要作用[1]。 在生理條件下，NO表達量較低，而在病理情況下表達上調[2]。發生腦缺血損傷時，NO在氧化應激損傷中扮演了重要角色[3]。在病理條件下大量表達的NO與超氧陰離子(Superoxide anion, O2-)等活性氧反應的產物——過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite, ONOO-)，可氧化蛋白質的酪氨酸殘基，使許多重要的蛋白質或酶失活，產生容易被檢測到的穩定終產物3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine, 3-NT)[4]。ONOO-使蛋白質結構被破壞，導致多種生物酶失活，影響細胞代謝。因此，3-NT作為NO介導的蛋白質損傷的生物標志物，也可以間接反映組織中NO的含量[5]。

內質網(endoplasmic reticulum, ER)是蛋白質合成的重要場所，是細胞代謝過程中不可或缺的一環，在各種病理過程中起著關鍵作用。 ER內環境平衡的破壞可能導致內質網應激(ER stress, ERS)，導致蛋白質不能正確折疊，激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)，以保護細胞免受毒性聚集蛋白質的侵襲[6]。UPR的激活導致ER伴侶蛋白水平升高，激活包括PERK/eIF2α 等信號轉導通路，啟動細胞凋亡程序。C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)是PERK/eIF2α通路下游的核轉錄因子，在ERS發生時大量表達，進而引起細胞凋亡[7-10]。本研究采用大腦中動脈梗死( middle cerebral artery occlusion， MCAO) 再灌注模型大鼠，通過腹腔注射NO清除劑Carboxy-PTIO(C-PTIO)清除大鼠體內的NO，觀察其對大鼠腦缺血再灌注后24 h ERS產生的影響，從而進一步探討NO和ERS在腦缺血再灌注過程中的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取體質量280～320 g的SPF級健康雄性SD大鼠，購自北京維通利華實驗動物公司[許可證號：SCXK(京) 2012-0001]，于SPF級動物房恒溫恒濕飼養，術前12 h禁食水。將18只大鼠按照數字表法隨機分為3組：假手術(Sham)組、MCAO組、MCAO+ C-PTIO組。C-PTIO需現用現配溶于0.9%(質量分數)氯化鈉注射液中，于術前1h腹腔注射給藥(0.6 mg/kg)[11]，Sham組和MCAO組大鼠腹腔注射同等體積的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液。

1.2 主要儀器設備

手術顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、小動物呼吸機(Harvard Apparatus公司，美國)、小動物麻醉機(Harvard Apparatus公司，美國)、反饋式肛溫調節儀(CMA 150，Carnegie Medicin公司，瑞典)、雙極電凝(ACC100，德威公司)、冰凍切片機(Thermo Fisher Scientific公司，美國)、熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.3 試劑

恩氟烷(河北一品制藥有限公司)；C-PTIO(Sigma公司，美國)；水合氯醛(首都醫科大學宣武醫院)；3-NT抗體(Abcam公司，英國)；CHOP抗體及p-eIF2α抗體(CST公司，美國)等。

1.4 動物模型制作

MCAO大鼠模型的制備依照改良Zea Longa法[12]。在70%(體積分數)N2O和30%(體積分數)O2中混合5%(體積分數)恩氟烷誘導麻醉，而后改用面罩吸入2%(體積分數)恩氟烷維持麻醉。沿大鼠頸部正中線做一縱行切口，分離并夾閉右側頸總動脈、結扎并凝斷頸外動脈，將尼龍線栓(頭端直徑為0.38 mm)自頸外動脈殘端插進頸內動脈，到達距頸外動脈和頸內動脈分叉約18 mm處固定線栓。術中檢測大鼠心率血壓，并使用反饋性控溫毯監測術中大鼠肛溫，使其維持在(37.0±0.5) ℃。缺血90 min后，將線栓拔出進行再灌注。術后大鼠飼養于SPF級動物實驗室24 h，自由進食飲水。

1.5 免疫熒光雙標染色

各組大鼠于再灌注24 h后，用水合氯醛腹腔注射麻醉，快速斷頭取腦包埋，行連續冰凍切片(厚度20 μm)。首先將腦組織冰凍切片室溫干燥后經4%(質量分數)多聚甲醛固定10 min，PBS洗后，用含有0.2%(體積分數)TritonX-100的PBS孵育約10 min，PBS洗后，用5%(體積分數)的山羊血清在室溫下封閉30 min，滴加一抗(3-NT 1∶400，CHOP 1∶400，p-eIF2α 1∶400)，4 ℃孵育一抗過夜。次日將切片取出，PBS洗后，滴加熒光二抗(1∶300)，在室溫下避光孵育1h。PBS洗后，最終用含4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)的封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察。陰性對照組用PBS代替一抗進行孵育。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 C-PTIO抑制MCAO 大鼠腦缺血半暗帶區CHOP的表達

免疫熒光染色切片于鏡下可見，Sham組大鼠大腦右側額頂葉皮質沒有CHOP陽性的紅色熒光染色，而MCAO組與C-PTIO組大鼠缺血側額頂葉皮質及海馬區均可見CHOP陽性細胞。與Sham組相比，MCAO組大鼠CHOP陽性細胞數量明顯增多；與MCAO組相比，C-PTIO組大鼠缺血半暗帶區CHOP陽性細胞數量明顯減少(圖1A)，差異具有統計學意義(P<0.05，圖1B)。

2.2 C-PTIO抑制MCAO大鼠缺血半暗帶區p-eIF2α的表達

免疫熒光結果顯示，Sham組大鼠腦組織沒有p-eIF2α蛋白陽性的紅色熒光，MCAO組大鼠腦組織額頂葉皮質于鏡下可見大量紅色熒光，大腦缺血半暗帶區p-eIF2α陽性細胞數量較Sham組明顯增高。C-PTIO組大鼠腦組織切片缺血半暗帶區p-eIF2α陽性細胞數量較MCAO組明顯減少(圖2A)，差異有統計學意義(P<0.05，圖2B)。

2.3 大鼠腦缺血半暗帶區CHOP、p-eIF2α分別與3-NT共定位

通過免疫熒光雙標染色可見，CHOP和p-eIF2α陽性細胞均呈紅色熒光，3-NT陽性細胞為綠色熒光，細胞核染色為藍色熒光。合并圖像后，綠色熒光與紅色熒光重合，說明CHOP和p-eIF2α與3-NT共定位，提示缺血再灌注后CHOP與p-eIF2α蛋白表達量的增加與NO的過量產生具有相關性(圖1、2)。

圖1 Carboxy-PTIO(C-PTIO)減少大鼠缺血再灌注24 h腦缺血半暗帶區與3-NT相關的CHOP表達Fig.1 C-PTIO inhibits the expression of 3-nitrotyrosine (3-NT)-related C/EBP homologous protein (CHOP) in the ischemic penumbra of cortices of middle cerebral artery occlusion (MCAO) rats 24 h after reperfusion

A：Representative double immunofluorescence showed the colocalization of CHOP (red) and 3-NT (green) in the ischemic penumbra of cortices of MCAO rats at 24 h after reperfusion. Bar=20μm.B:quantification of CHOP-positive immunoreactive cells,Data were presented as means±SD(n=4).*P<0.05vsSham group,#P<0.05vsMCAO group;DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

圖2 Carboxy-PTIO(C-PTIO)降低大鼠再灌注24 h腦缺血半暗帶區與3-NT相關的p-eIF2α表達水平Fig.2 C-PTIO inhibits the expression of 3-nitrotyrosine (3-NT)-related p-eIF2α in the penumbra of middle cerebral artery occlusion (MCAO)rats at 24 h after reperfusion

A：Representative double immunofluorescence showed the colocalization of p-eIF2α (red) and 3-NT (green) in the ischemic penumbra of cortices of MCAO rats. Bar=20μm.B:quantification of p-eIF2α-positive immunoreactive cells. Data were presented as means±SD(n=4).*P<0.05vsSham group,#P<0.05vsMCAO group;DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

3 討論

腦缺血再灌注引起的能量代謝障礙是神經細胞損傷的重要原因，與此同時，大量產生的自由基引發的氧化應激也可引起細胞損傷[13]。在此過程中，細胞的適應性調控機制引起了人們的關注，ERS是應對損傷刺激的適應性反應之一。最近的研究[14-15]結果提示，在缺血再灌注損傷的過程中，ERS在一定程度上可以維持細胞內環境的穩態，產生神經保護作用，但是當損傷過于嚴重時，ERS激活細胞凋亡程序引起神經元凋亡。故而ERS在腦缺血再灌注引起的氧化應激損傷中發揮了重要的作用，但NO在此過程中扮演的角色尚不明確。

研究者[16]發現，內皮細胞產生胰島素抵抗時，NO的產生和利用度下降，內皮細胞ERS增強，導致內皮細胞損傷，而通過激活NO信號通路可減輕ERS對內皮細胞的損害[17]。在神經變性病中，也有前期研究[18]證實了低于細胞毒性濃度的NO和亞硝酸鹽顯著降低了同型半胱氨酸誘導的CHOP表達，表明NO和亞硝酸鹽對同型半胱氨酸誘導的ERS和凋亡的細胞具有保護作用。但由于缺血再灌注過程中NO在短時間內大量產生，其局部濃度遠遠高于生理狀態所需的NO水平，因此在本項研究中，利用特異性NO清除劑C-PTIO對腦缺血再灌注損傷中NO對ERS產生的影響進行了探究。

本課題組前期已發表的研究[19]結果表明，構建MCAO模型后，大鼠出現對側肢體偏癱，神經功能評分顯著降低，與此同時，通過2,3,5 -氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色可以發現大鼠大腦中動脈支配區出現梗死灶，模型穩定，組內差異小。通過對缺血再灌注不同時間點大鼠腦組織中的NO濃度進行ELISA檢測，筆者發現：發生腦缺血時，NO的產生在缺血后15 min達到峰值，隨后下降，直至再灌注時再次升高，至再灌注24 h達到頂峰。此外，筆者在對中藥大黃的提取物大黃酚進行藥理學研究[20-22]時發現：大黃酚可以通過減輕MCAO小鼠腦內由NO介導的神經元凋亡，從而對腦缺血再灌注損傷產生保護作用。以上研究提示，由于NO在腦缺血再灌注損傷早期即大量產生，因此很可能在整個病理生理過程的上游即參與腦缺血再灌注損傷。因而，在此基礎上，本研究選取缺血再灌注24 h大鼠腦組織，對NO導致神經元損傷的機制進行探究，發現在缺血再灌注24 h時，清除NO可明顯抑制缺血再灌注大鼠腦組織中由NO介導的蛋白質損傷。同時，C-PTIO也明顯降低了MCAO大鼠腦組織中ERS相關蛋白CHOP和p-eIF2α的表達量，但仍高于Sham組。CHOP與p-eIF2α均可與NO介導的蛋白質損傷標志物3-NT共定位。此外，筆者已發表的研究[20]證明，缺血再灌注后，腦缺血半影區的3-NT可與特異性神經元標志物共定位，不能與特異性星形膠質細胞標志物共定位，說明NO介導的細胞硝基化損傷主要發生在神經元中。綜上，筆者的研究結果提示，在缺血再灌注24 h后，神經元內ERS激活了PERK/eIF2α通路，導致細胞凋亡，且這一通路的激活與NO介導的氧化應激損傷相關。減少NO的產生，可以明顯抑制神經元內ERS相關的細胞凋亡通路。

ERS發生時，細胞通過激活內質網內泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin proteasome system, UPS)，處理細胞內堆積的未折疊蛋白，以應對ERS引起的損傷，維持內質網和細胞的正常形態和功能[23]。但是當損傷過于嚴重時，內環境穩態不能通過自我調節及時恢復，ERS隨即啟動細胞凋亡程序，清除受到損傷的細胞。ERS發生時，內質網內存在大量游離未折疊蛋白，此時蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)與結合的葡萄糖調節蛋白78(glucose regulating protein 78，GRP78)發生解離，GRP78與未折疊蛋白結合，使PERK被暴露出來，PERK之間相互聚合，磷酸化加劇，導致起始因子eIF2α被催化生成p-eIF2α，阻斷mRNA的翻譯[24-25]。同時，磷酸化的eIF2α使激活轉錄因子4活化增加，引起CHOP的過表達，激活ERS介導的多種信號通路，引起細胞凋亡。腦缺血缺氧觸發的內質網應激的級聯反應，最終導致神經細胞的凋亡[26]。

本研究探究了在急性腦缺血再灌注損傷早期，NO與ERS之間的關系，證明NO在腦缺血再灌注早期大量產生，引起神經元內ERS介導的神經元凋亡，清除NO可通過減輕神經元內ERS，產生神經保護作用。