促紅細胞生成素對新生大鼠高膽紅素血癥的腦保護作用

祝 巍，元熙哲， 孫智勇，張煒煜,3，高 燕

（1.吉林省婦幼保健院新生兒科，長春 130000；2.延邊大學附屬醫院兒科，吉林 延邊 133000；3.吉林省疾病預防控制中心微生物檢驗所，長春 130000）

新生兒高膽紅素血癥當前在新生兒中的發病率比較高，在臨床上主要表現為黃疸等癥狀，主要是由于胎兒肝臟清除膽紅素功能不成熟而引起，嚴重情況下可導致不可逆腦損傷的發生[1]。特別是過量的游離膽紅素可通過血-腦脊液屏障引起腦能量的代謝障礙，誘發興奮性氨基酸持續表達上升，也可產生活性異常的Na+-K+-ATP 酶，誘發細胞內Ca2+超載，導神經細胞膜的功能被損壞，繼而導致腦水腫[2-4]。促紅細胞生成素（erythropoietin, EPO）是一種糖蛋白激素，也為一種可作用于骨髓造血細胞，促進紅系祖細胞增生、分化，最終成熟的內分泌激素[5-7]。現代研究表明，EPO是一種新型的神經保護藥物，具有顯著的營養神經及神經保護作用的功能，并且其還具有抗細胞凋亡、抗氧化、抗炎，營養神經活性，可提高腦組織對缺血缺氧的耐受能力等多種作用[5-6]。本研究通過建立新生大鼠高膽紅素血癥模型，探討EPO對新生大鼠高膽紅素血癥的腦保護作用，以為高膽紅素血癥的診治及用藥提供一定的理論依據。現總結報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選擇7 d齡清潔級SD 雄性新生大鼠共60只，體質量（15.02±1.53）g，由吉林省婦幼保健院實驗動物中心提供。

1.2 實驗試劑 晶體膽紅素、鼠神經生長因子制劑購自美國sigma公司，EPO購自上海生工公司，IL-6、SOD、MDA、TNF-α等檢測試劑盒購自北京華英生物技術。

1.3 實驗儀器 電子分析天平儀、全自動組織脫水機、低溫高速離心機器、電熱恒溫干燥箱等均由本實驗室提供。

1.4 動物分組與處理 所有大鼠隨機分成3組：模型組、對照組與EPO組，每組各20只。

所有大鼠都建立了高膽紅素血癥模型，模型制作參照文獻[7]的制備方法，劑量為50 μg/g 的膽紅素溶液被腹腔注射于新生兒大鼠中，常規進行飼養。對照組在模型建立后即刻給予腹腔注射鼠神經生長因子，劑量為50 μg/kg·d，1次/d，共3 d。EPO組在對照組治療的基礎上經頸靜脈注射EPO（300 U/kg），1次/d，共3 d。模型組注射同劑量的PBS，1次/d，共3 d。

1.5 觀察指標 1）觀察大鼠的一般行為學狀況。2）所有大鼠在治療后1 d、治療后2 d與治療后3 d進行按照Tarlov評分標準進行神經行為學評分：0分為無可察覺的后肢活動；1分為可察覺的微弱后肢活動，但無法對抗重力；2分為后肢能對抗重力但無法站立；3分為可正常站立、行走，但不能正常跳躍；4分為后肢功能完全恢復，能正常跳躍。3）取處死大鼠的靜脈血樣本，離心后取上層血清，采用酶聯免疫法檢測組織中的IL-6和TNF-α的表達情況，嚴格按照試劑盒進行操作。

1.6 統計學方法 選擇SPSS 20.00軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（±s） 表示，對比為t檢驗；計數資料采用百分比（%）表示，對比采用χ2檢驗，檢驗水準為α = 0.05。

2 結果

2.1 一般行為學狀況 3組大鼠在模型建立前都呼吸平穩，對外界刺激反應靈敏，無翻滾、俯伏、煩躁等行為學表現；建模后大鼠皮膚黃染逐漸加重，模型組大鼠出現翻滾、俯伏與對外界刺激反應遲鈍等癥狀，對照組大鼠的行為學異常表現顯著輕于模型組，而EPO組的大鼠的行為學異常輕于對照組，無煩躁、翻滾伏等行為學表現，對外界刺激反應靈敏。

2.23 組大鼠不同時間點的神經行為學評分對比 見表1。

表13組大鼠不同時間點的神經行為學評分對比（±s ，n = 20） 分

注：與對照組對比，# P＜0.05；與模型組對比，△P＜0.05

組 別 治療后1 d 治療后2 d 治療后3 d EPO組 3.44±0.24#△ 3.56±0.43#△ 3.50±0.51#△對照組 2.54±0.22△ 2.58±0.41△ 2.58±0.88△模型組 1.34±0.29 1.28±0.25 1.29±0.34

2.33 組術后3 d海馬組織的SOD、MDA含量對比 見表2。

表23組術后3 d海馬組織的SOD、MDA含量對比（±s ，n = 20） μmol/L

表23組術后3 d海馬組織的SOD、MDA含量對比（±s ，n = 20） μmol/L

注：與對照組對比，# P＜0.05；與模型組對比，△P＜0.05

組 別 SOD MDA EPO組 156.40±14.63#△ 0.78±0.21#△對照組 122.87±12.74△ 2.09±0.51△模型組 66.30±10.92 4.98±0.81

2.43 組術后3 d的血清炎癥因子表達對比 見表3。

表33組術后3 d的血清炎癥因子表達對比（±s ，n = 20） ng/mL

表33組術后3 d的血清炎癥因子表達對比（±s ，n = 20） ng/mL

注：與對照組對比，# P＜0.05；與模型組對比，△P＜0.05

組 別 IL-6 TNF-α EPO組 3.98±1.05#△ 2.76±0.78#△對照組 7.34±2.13△ 6.49±1.68△模型組 13.67±3.89 11.76±3.22

3 討論

高膽紅素血癥約出現在70%的新生兒中，早期癥狀不明顯，但是隨著病情的進展，可發展為膽紅素腦病，誘發患兒出現智力障礙，造成腦損傷[8-10]。由于膽紅素腦病早期臨床特異性表現缺乏，在治療上可存在滯后性，為此早期進行治療能發揮有效的腦保護作用。SD大鼠是屬于生后發育型，7 d的SD大鼠其神經系統發育相對成熟度類似胎兒或新生兒，也可反映新生兒的發育狀況，當前在基礎研究中比較常見[11]。

鼠神經生長因子是一種有效的腦保護劑，能夠通過多種途徑來減輕有害因素對腦組織的損害，保護神經元。EPO是一種多功能營養因子及神經保護因子，能通過激活背根神經節細胞上鈣通道，調節細胞內鈣濃度發揮其神經細胞保護作用，促進神經功能恢復[12-14]。EPO也可阻止缺氧和興奮性神經毒物谷氨酸所介導的神經元死亡，可減輕缺氧、谷氨酸等氧化應激對神經細胞的損傷[15]。本研究顯示EPO組與對照組治療后1 d、治療后2 d與治療后3 d的Tarlov評分高于模型組（P＜0.05），EPO組也高于對照組（P＜0.05），表明EPO的應用能發揮腦保護作用，促進大鼠神經行為功能的恢復。

新生大鼠高膽紅素血癥的發生機制還不明確，但是可導致腦損傷，且目前臨床上暫無有效的治療藥物，也不利于新生兒的預后改善[16]。常規研究認為高膽紅素血癥的發生與發展涉及到炎癥因子與趨化因子的表達變化調節、細胞內外離子情況變化、腦組織局部脂質的過氧化以及自由基的產生等[17]。特別是海馬組織膜結構含有豐富的脂質，可產生大量氧自由基，高膽紅素血癥可使神經細胞線粒體氧化還原酶系脫耦聯，導致神經元的繼發性損害[18]。本研究顯示治療后3 d，EPO組海馬組織的SOD含量高于對照組與模型組（P＜0.05），MDA含量低于對照組與模型組（P＜0.05），對照組與模型組對比差異也有統計學意義（P＜0.05）。從機制上分析，EPO具有拮抗谷氨酸鹽對神經細胞的興奮性毒性反應，可使紅細胞內降低的抗氧化損害的酶恢復至正常水平而發揮腦神經保護作用；并且EPO能有效增加SOD活性，減少再腦損傷后MDA含量，抑制中性粒細胞活性，從而更加有效發揮減少活性氧的生成、減輕線粒體超載的作用。

在高膽紅素血癥的發病過程中，可表現為胞內NF-kB途徑的激活，促使IL-6、TNF-α的釋放。當前研究表明IL-6、TNF-α等炎癥因子的產生和釋放是外界刺激信號經過細胞內各種信號轉導通路向細胞核介導的結果，抑制炎癥因子的釋放可避免組織器官在結構和功能上進一步的損害，實現了對器官損傷的防治作用[19]。本研究顯示治療后3 d ，EPO組的IL-6和TNF-α值低于對照組與模型組（P＜0.05），對照組低于模型組（P＜0.05）。從機制上分析，EPO可抑制炎癥反應，增加腦血流量，減輕水腫，抑制血管活性，穩定細胞膜和溶酶體膜；并且其也能減輕組織水腫、減少組織細胞結構的損害，抑制炎癥因子的釋放，從而增強機體對高膽紅素血癥的耐受能力[20]。同時EPO也可以促進腦損傷局部神經元及膠質細胞的修復，有效動員骨髓間充質干細胞向腦損傷部位聚集，加快腦損傷的恢復[21]。本研究也有一定的不足，體內模型與臨床治療畢竟還存在很大的差距，且納入的大鼠數量較少，沒有進行劑量分析，導致可能存在研究偏倚，將在后續研究中深入分析。