慢性房顫犬脂肪墊Notch-1表達變化

班努·庫肯，買力旦木·艾克拜，鐘小蘭*

(新疆醫科大學第二附屬醫院 1.心內科;2.心電圖室，新疆 烏魯木齊830028)

心房顫動(簡稱房顫)是臨床上最常見的快速心律失常，60歲以上人群中發生率高達1%，并且有很高的致殘率和致死率[1]。雖然房顫病因和發生機制的研究已經取得了較大進展，治療卻依然令人棘手。心臟內源性自主神經系統主要由位于心臟表面、大血管附近的神經節叢以及連接神經叢的神經纖維互相連接構成。內源性自主神經系統的活性增高能夠極大地改變心房肌細胞的電生理特征，可增加房顫誘發的幾率，其中脂肪墊神經叢在房顫的發生和維持中具有重要意義。Notch信號通路是一個高度保守的信號系統，在心血管發育等生理、病理過程中有重要的作用。Notch有4個Notch同源基(Notch1-4)和5個配體，Notch與配體 Jagged /Delta結合后，形 成 NICD進入細胞核，與RBP-Jκ結合一起激活下游靶基因Hes、Hey等靶基因的轉錄[2]。 Notch的激活與表達變化是否是房顫電重構和神經重構中的一種普遍參與機制至今未見相關報道。本項目擬基于慢性起搏犬左心房致房顫模型的建立，研究慢性房顫犬竇房結脂肪墊(Sinoatrial node fat pad，SAN-FP)神經叢中Notch-1蛋白表達變化及Notch-1、NICD含量變化，進一步闡明SAN-FP神經叢Notch信號通路與房顫的發生發展有密切關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1研究對象 健康比格犬，體重18±2.66 kg，年齡7-9歲，雌雄不拘。動物質量屬于一級標準。實驗設計及實施均經過動物倫理委員會的審核批準。

1.1.2實驗動物分組 實驗動物隨機分為2組，假手術組(n=5)：行微創開胸術，但不植入起搏器。房顫組(n=5)：微創開胸術，左心耳植入起搏器起搏8W。

1.2 實驗方法

1.2.1持續快速心房起搏(rapid atrial pacing，RAP)犬致房顫模型制作

術前動物禁食水12 h。常規消毒手術器械、手術服及手術環境。嚴格按照無菌技術要求操作。鹽酸氯胺酮注射液(20 mg/kg)肌肉注射基礎麻醉后，待犬的狀況穩定后行氣管插管，呼吸機輔助呼吸，調節氧流量4-6 L/min，潮氣量為20 mL/kg，呼吸壓力0-2 Kpa。應用LEAD-2000多道電生理記錄儀動態記錄犬正常II導聯心電圖。犬右側臥位，左側胸部剪除犬毛，用碘酒、酒精消毒切口后，應用微創心臟外科技術作左腋下小切口，長約5-7 cm左右，以4-5肋的肋間隙為切口，逐層切開皮膚、皮下肌層，用合適的開胸器撐開切口，逐層開胸打開心包，暴露左心耳，采用荷包縫合，將起搏電極縫合固定于左心耳的底部，起搏電極用人的心房翼狀起搏電極，然后將電極尾端與實驗用動物埋藏式高頻心臟起搏器相連，將起搏器埋藏于胸部皮下囊袋內，逐層縫合肌肉及皮下組織、皮膚。無菌紗布包扎切口。觀察犬的癥狀及體征。犬的一般情況穩定，傷口拆線后開啟起搏器予以連續起搏8周。房顫定義為心房無序的電活動，心電圖表現為P波消失，代之以大小不等間隔不均，形態不一的 f 波，頻率 450-600次/分，RR間期不等，持續 10 s 以上。

脂肪墊定位：成年犬在術前12 h禁食，6 h禁飲，手術前洗澡。肌注氯胺酮(15 mg/kg)基礎麻醉，然后以3%的戊巴比妥鈉(20 mg/kg)靜脈注射麻醉后，仰臥固定于手術臺上，分別在雙后肢、雙前肢和胸前刺入自制銀質針頭，按照標準連接心電圖導線，動態記錄體表導聯心電圖。氣管插管后，剪除犬毛。取右側位，沿左側第4肋間剪開皮膚，分離皮下和肌肉組織，開胸器順肋間橫向撐開胸廓，切開心包制作心包吊籃，暴露心臟左心房和左上下肺靜脈，在主動脈根部和上腔靜脈中部之間可見一脂肪墊(SVC-Ao FP)，進行電生理測試之后將左側切口縫合。取左側臥位，沿右側第4肋間剪開皮膚，分離皮下和肌肉組織，開胸器順肋間橫向撐開胸廓，制作心包吊籃，在左心房和右上肺靜脈之間可見一脂肪墊(SAN- FP)。進行電生理測試之后將右側切口縫合。電生理測試：使用自制電極刺激心臟神經叢的神經元。參數如下：刺激頻率 20 Hz，脈沖持續時間 0.1 ms，刺激時間 50 ms，電壓1.6-2.4 V。此高頻刺激不會興奮心房，當心率逐漸減慢達50%為脂肪墊所在位置。

1.2.2HE染色 (1)取2組SAN-FP組織切片烘片20分鐘后，二甲苯20分鐘，依次放入梯度乙醇中。(2)入蘇木精液染色5分鐘，加入1%鹽酸乙醇液分化數秒鐘，切片變紅。自來水沖洗；(3)切片置入75%乙醇伊紅液數秒鐘后，放入梯度乙醇中數秒脫水；(4)滴加中性樹膠于組織上，取清潔蓋玻片覆蓋，顯微鏡下觀察組織像。

1.2.3免疫組化測定 兩組實驗犬SAN-FP石蠟包埋，切片。采用SP免疫組化染色法對Notch-1染色。陰性對照以PBS代替一抗，Notch-1著色表現為胞漿染成棕褐色為陽性結果，分別計算陽性細胞數。

1.2.4雙抗體夾心法(ELISA)測定組織中Notch-1和NICD含量 用犬蛋白抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔板中依次加入犬心臟脂肪墊組織蛋白，再與HRP標記的蛋白抗體結合，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD)值，通過標準曲線計算樣品中犬蛋白的濃度。

2 結果

2.1 模型制作完成情況手術完畢時及起搏8周后，房顫組制作犬慢性房顫模型成功率達到100%。起搏器開啟后，經心電圖檢測，房顫組犬經快速起搏左心耳均可成功誘發房顫。

2.2 脂肪墊定位及組織學特點電極刺激心臟脂肪墊后，假手術組實驗犬均未出現房顫，房顫組均出現房顫圖形，如圖1。將SAN-FP定位后行HE染色后可見脂肪細胞中散在分布的神經叢，如圖2。

2.3 2組Notch-1表達變化假手術組SAN-FP蛋白表達呈深棕色，部分表達呈斑點分布在心臟表面神經元。房顫組SAN-FP蛋白表達呈深棕色。2組SAN-FP 蛋白陽性表達計數結果顯示，假手術組有少量Notch-1蛋白表達。與假手術組比較，房顫組Notch-1蛋白表達顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；如圖3和表1。

圖1 房顫組犬SAN-FP刺激后電生理圖

圖2 SAN-FP的HE染色(×400) 圖3 2組SAN-FP內Notch-1表達變化

表1 2組SAN-FP Notch-1蛋白陽性表達計數(個/視野，

注：與假手術組相比，*P<0.05。

2.4 2組SAN-FP內Notch-1和NICD含量變化與假手術組比較，房顫組基線水平Notch-1和NICD濃度差異無統計學意義(P>0.05)。實驗8周后，與假手術組相比，房顫組Notch-1和NICD濃度顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；如表2。

3 討論

心臟脂肪墊是一種具有調節器官生物活性的代謝器官，由于心外膜脂肪墊與心肌直接毗鄰，且兩者共用一套微循環系統，故心外膜脂肪墊產生的因子可以通過內分泌或旁分泌機制直接作用于心房肌，對心外膜脂肪墊進行干預將可調節心臟內在自主神經系統的活性。長期持續性房顫使心房和脂肪墊自主神經相關纖維、神經節、受體等空間分布和遞質發生變化，促進局部心肌發生結構及神經重構，參與房顫發生或維持。Notch信號通路相關蛋白在心臟中均有表達，其過表達與缺乏均可造成心臟發育異常[3]。Notch 信號下游基因轉錄蛋白與心肌富含的心肌轉錄因子( GATA) 相結合，可抑制GATA介導的心肌基因轉錄，調節心臟基因的表達。GATA-4 直接影響心臟結構基因的表達，包括α-肌球蛋白重鏈、肌鈣蛋白 C、心房利鈉肽、腦利鈉肽等，以及通過其鋅指結構與其他心臟特異性的轉錄因子如 Nkx2-5、TBX5、胚胎成纖維細胞等相互作用形成復合物發揮轉錄調控作用[4，5]。有研究證明，Notch信號通路在促進受損后心肌保護和心肌再生中發揮重要作用[6]。Yang等[7]研究顯示，在心肌缺血時Notch信號通路激活能夠顯著提高心臟收縮功能，減少梗死面積，抑制心肌細胞凋亡并促進新生血管的生成。同時研究證實，血管損傷后Notch受體和下游靶基因都會發生特征性的改變。Brandt等[8]研究顯示，在血管損傷實驗模型中，Notch信號通路中許多分子都發生了時序性改變，包括Notch1-3、Jagged1-2、Hey1-2。Gude等[9]研究顯示，Notch信號通路相關蛋白在心臟中均有表達，其過表達與缺乏均可造成心臟發育異常。Li等[10]提出了Notch募集干細胞、促進新生血管形成及介導細胞進一步分化等機制。Gude NA[11]等研究認為Notch 信號途徑對心肌細胞具有保護作用，該作用是 Notch/Hey上調磷酸化AKt的表達，激活了磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKt/PKB)傳導途徑而實現的。Notch1信號通過與Akt、ERK、NRG1-ErbB 等信號通路相互作用而在心肌缺血損傷和心肌保護中發揮重要作用。上述國內外資料顯示，Notch信號通路在心肌缺血和新生血管形成、心功能改善等方面發揮保護作用，使人們開始認識到Notch信號通路可能參與了房顫的發生與維持。但在房顫發生中作用如何，干預其信號通路激活是否會產生抑制/啟動房顫作用?目前國內外各種研究資料尚未有相關報道。本研究成功建立慢性房顫犬模型，結合電刺激SAN-FP定位，組織學切片顯示SAN-FP由大量的脂肪細胞、散在分布的神經叢組成。免疫組化結果顯示SAN-FP神經叢中可見Notch-1蛋白表達，房顫組SAN-FP內Notch-1顯著表達，同時ELISA法顯示SAN-FP內Notch-1和NICD含量明顯升高，結果顯示房顫發生發展過程中SAN-FP神經叢內Notch-1與配體結合后以NICD形式活化進而影響下游靶基因。同時Notch-1可能在房顫發生的不同時期表達，并受到SAN-FP內脂肪細胞因子和神經相關因子的調節，從而對心肌細胞的離子通道、功能蛋白分子發揮作用。

表2 2組Notch-1和NICD濃度變化

注 ：與基線水平比較，*P<0.05；與假手術組比較，#P<0.05。

Notch信號通路是高度保守的信號系統，通過Notch 配體與受體的相互作用而轉導細胞間和細胞內信號，從而精確調控心肌細胞的分化，在心血管發育等生理、病理過程中有重要的作用。心外膜脂肪墊自主神經在房顫的發生或維持中所起的作用并不一定是“促進”，而更傾向于“協調”作用。本實驗將進一步研究：心臟脂肪墊內神經叢功能和結構復雜，快速持續高頻電刺激心房肌可導致刺激脂肪墊內神經叢內神經活性和功能及Notch信號通路中哪些靶基因發生量變和功能改變。