利用AFLP 標記分析云南紅花優異種質資源的遺傳多樣性

胡尊紅，王沛琦，楊 謹，胡學禮，劉旭云

（云南省農業科學院經濟作物研究所，云南昆明650205）

紅花（Carthamus tinctorius L.）為菊科紅花屬的一年生雙子葉草本植物，別名草紅花、菊紅花等，是一種花、油兩用以及栽培歷史悠久的經濟作物[1]。紅花花瓣作為提取天然黃、紅花色素的原料和中藥材使用。常見的紅花為不帶子房的管狀干燥花，味辛、性溫[2]。紅花的主要藥用活性成分為羥基紅花黃色素A（Hydroxysafflor yellow A，HSYA），具有活血化瘀，通經止痛之功效，常用來治療血脈閉塞、心絞痛和冠心病等疾病[3-4]。紅花種子可以榨油，富含不飽和脂肪酸，多為高檔烹飪食用油。紅花起源于大西洋東部、非洲西北部及地中海沿岸[5]。我國紅花栽培歷史悠久，主要分布西北、中原及西南地區，其中，新疆種植面積最大，其已成為西北地區春播和西南地區秋播的優勢作物[6]。從20 世紀90 年起，云南省農業科學院經濟作物研究所就從事紅花種質資源收集、評價和利用等工作，選育云紅一號、云紅二號和云紅三號等云紅花系列新品種，也稱滇紅花，在全國范圍內種植面積廣泛，產量高、品質好，受全國各地農戶青睞[7]。

目前，紅花的研究主要集中在紅花化學成分[8-9]、藥理作用[10-12]及種質資源評價[13-14]、新品種選育[15-16]等方面。雖然云南紅花種質資源在相關文獻已有報道[17-19]，但多集中在農藝性狀上的表型差異。少數、零星云南紅花種質也通過SRAP、SSR 和AFLP 標記進行了遺傳多樣性評價，但云南地形錯綜復雜，氣候類型迥異，形成云南獨特的紅花種質，其分布廣泛、表型多樣，類型豐富[20]。因此，多樣本、多類型及多方面比較才能全面、準確反映云南紅花種質遺傳多樣性。

本研究從560 份紅花種質資源中通過表型多樣性分析，篩選出50 份優異種質，擬通過AFLP 標記對云南紅花種質的遺傳分化和遺傳結構比較進行遺傳多樣性分析，旨在為云南紅花種質資源收集、保護以及紅花新品種選育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試紅花材料是云南省不同類型的種質資源群體材料，采自云南省農業科學院經濟作物研究所紅花種質資源圃（表1）。

表1 供試紅花種質資源材料

續表1

1.2 試驗儀器及試劑

AFLP 分析試驗主要是在云南省農業科學院經濟作物研究所的分子生物學實驗室進行，所用的主要儀器有DNA 擴增儀（Bio-Rad 9700，美國），紫外凝膠成像儀（Bio-Rad UVP GDS-8000，美國），高速冷凍離心機（Hermle Labortechnlk，德國），多用電泳儀電源（DYY-12C，北京），測序電泳儀（JUNYI，北京），純水儀（Aquapro，重慶），紫外分光光度計（UV-7504，上海）。

主要試劑為Taq DNA 聚合酶、T4 DNA Ligase、EcoR I 限制性內切酶和Mse I 限制性內切酶，均購自 Ferments 公 司；RNase、dNTP、ATP、TEMED、Acrylamide、Bis-acrilamide 購自Sigma 公司；Mse I adapter 和EcoR I adapter 和AFLP 引物由上海生工公司合成；其他試劑均為國產分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅花DNA 的提取 其在傳統CTAB 法基礎上進行改進[21]。針對紅花組織中含酚類物質、多糖、單寧物質等較高的特點，添加不同的抗酚類氧化褐變物質，防止DNA 褐化。苗期隨機選取紅花各10 株，每株取1～2 片葉片構成試驗材料混合DNA 池，用于提取DNA。

1.3.2 紅花AFLP 分析 其參照VOS 等[22]、胡尊紅等[23]的方法進行適當調整。

1.3.2.1 紅花模板DNA酶切和連接 其采用EcoR I、Mse I 限制性內切酶的雙酶切體系進行。15 μL 的雙酶切體系：DNA 200 ng；EcoR I（10 U/μL）2 μL；Mse I（5 U/μL）0.2 μL；TangoTMbuffer 3.0 μL；加水至15 μL。37℃保溫4h，65℃保溫3h，80℃滅活10min。

15 μL 連接體系：酶切產物5.0 μL；EcoRⅠadapter（5 pmol/μL）1.0 μL；MseⅠadapter（50 pmol/μL）1.0 μL；10×buffer 2.0 μL；T4 連接酶（5 U/μL）0.4 μL；加水至15 μL。22 ℃過夜（10～12 h）。連接完成后，65 ℃滅酶活。反應完成后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2.2 預擴增 預擴增選用（E＋0）/（M＋0）引物組合進行。20 μL 的預擴增體系：連接產物4.0 μL；E（A）（10 μmol/μL）1.0 μL；M（C）（10 μmol/μL）1.0 μL；10×buffer 2.0 μL；Mg2+（25 mmol/μL）1.2 μL；dNTP（10 mmol/μL）0.4 μL；Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL；加水至20 μL。94 ℃3 min；94 ℃30 s，56 ℃45 s，72 ℃1 min，30 個循環；再72 ℃延伸8 min。反應結束后，用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測，將反應產物稀釋20 倍。

1.3.2.3 選擇性擴增 選用（E＋3）/（M＋3）或（M＋4）引物組合（表2）進行。20 μL 的選擇性擴增體系：預擴產物4.0 μL，10×buffer 2.0 μL，Mg2+（25 mmol/μL）1.2 μL，dNTP（10 mmol/μL）0.4 μL，Taq 酶1 U，引物（10 μmol/μL）各1.0 μL，加水至20 μL。

表2 AFLP 選擇性擴增引物

反應體系為：94 ℃3 min；94 ℃30 s，65 ℃45 s，72 ℃1 min，10 個循環，每循環降7 ℃；再94 ℃30 s，56 ℃45 s，72 ℃1 min，25 個循環；72 ℃延伸8 min。

1.3.2.4 引物的篩選 根據AFLP 分子標記研究紅花屬植物的相關文獻，從常用的64 對AFLP 選擇性擴增引物中篩選引物，先用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，淘汰部分擴增效果差或無擴增條帶的引物，再依據聚丙烯凝膠電泳篩選出條帶清晰、多態性高的引物用于正式試驗。

1.3.2.5 銀染 將玻璃板放入純水中，清洗1 min；然后將玻璃板放入新配制的0.2%AgNO3染色液中，輕搖10～20 min。將染色后的膠板放入純水中5～10 s，迅速取出并豎起控水；然后把膠板放入新配好的顯影液（8 g NaOH，6.4 mL 甲醛，加水至1.6 mL）中，輕搖振蕩，直至條帶出現。用純水清洗2 次，每次1 min，然后豎起晾干。

1.4 數據分析

AFLP 擴增產物在相同水平遷移位置的以0，1統計，并建立由“0，1”組成的AFLP 原始數據的二元矩陣。使用NTSYSpc 2.2 計算Jaccard 遺傳相似系數。運用SHAN 程序，構建系統聚類分析樹狀圖。使用POPGEN 3.2 軟件分析標記位點的多態性條帶百分率（PPB）、有效等位基因數Ne、多態性信息指數（PIC）、Shannon-Weaver 多樣性指數以及Nei 遺傳距離和遺傳一致度。

2 結果與分析

2.1 引物多態性分析

在AFLP 引物多態性分析中，從102 對引物中篩選出8 對多態性高、穩定性好的引物組合，共擴增331 條帶，142 條多態性帶，擴增片段長度多集中100～800 bp，多態性比率為33.42%～55.80%，平均多態性為42.42%（表3）。說明AFLP 標記技術能很好地揭示云南優異紅花種質的多態性，為后續分析遺傳多樣性奠定基礎。

表3 8 對引物組合在紅花AFLP 分析中的多態性比較

2.2 UPGMA 聚類分析

采用NTSYS 2.0 軟件對AFLP 數據進行分析。由圖1 可知，50 份紅花優異種質的遺傳相似系數為0.56～0.99，說明這些云南紅花種質資源在種內具有很大的遺傳分化；同時在相似系數0.64～0.66把所有紅花材料可分為4 個組：Ⅰ組包括YnHF-1，YnHF-12，YnHF-43，YnHF-42，YnHF-14，YnHF-2，YnHF-5，YnHF-13，YnHF-4，YnHF-8，YnHF-36，YnHF-44，YnHF-40，YnHF-45，YnHF-3，YnHF-7，YnHF-30；Ⅱ組包括YnHF-9，YnHF-10，YnHF-25，YnHF-27，YnHF-28，YnHF-29，YnHF-35，YnHF-20，YnHF-21，YnHF-41，YnHF-50，YnF-22，YnHF-31，YnHF-37，YnHF-39；Ⅲ組包括YnHF-49，YnHF-11，YnHF-17，YnHF-23，YnHF-24，YnHF-16，YnHF-26，YnHF-18，YnHF-32YnHF-33，YnHF-47，YnHF-15，YnHF-19；Ⅳ組包括YnHF-6，YnHF-34，YnHF-38，YnHF-46。聚類結果表明，50 份材料并沒有以傳統表型而聚在一起，而是分成了4 個組。

2.3 遺傳分化與結構分析

紅花群體遺傳分化分析結果如表4 所示，所有群體的總基因多態性（Ht）為0.283 3，群體內基因多態性（Hs）為0.157 4，證明群體內的分化較大。群體間的遺傳分化系數（Gst）為0.444 5，說明群體間的變異有44.45%來自不同群體間的差異；總的基因流（Nm）為0.624 8，說明群體內的基因流動性較大。

表4 6 個群體內的基因多樣性和基因流

群體間遺傳分化分析結果如表5 所示，50 份紅花材料分成6 個群體，各群體間的遺傳一致度在0.747 9～0.909 0，其中，條紋殼群體和抗銹病群體間具有最高的一致度，為0.909 0；無刺群體與黃花群體間的遺傳一致度次之，為0.886 7，黃花群體和大粒群體的遺傳一致度最低，為0.747 9。

表5 6 個紅花群體間遺傳相似性和遺傳距離

2.4 遺傳多樣性分析

由表6 可知，50 份紅花材料的6 個群體共擴增出120 個多態性位點，占總位點的80%，其中，紅花條紋殼群體、抗銹病群體和無刺群體的多態性位點比率分別為67.50%，57.50%和55.00%。3 個種群的等位基因觀察數（Na）分布在1.250 0～1.675 0，全部群體則達到了1.800 0；有效等位基因數（Ne）分布在1.120 4 ～1.426 9，全部群體則達到了1.433 4。Nei 基因多樣性指數分布在0.077 1～0.251 3，其值由大到小順序為條紋殼群體＞高亞油酸群體＞抗銹病群體＞無刺群體＞大粒群體＞黃花群體；Shannon 指數分布在0.120 0～0.373 8，其值由大到小為條紋殼群體＞抗銹病群體＞高亞油酸群體＞無刺群體＞大粒群體＞黃花群體。說明紅花條紋殼群體內的變異最大，其次為抗銹病群體，黃花群體變異最小。

表6 基于AFLP 數據的6 個紅花群體的遺傳多樣性

3 結論與討論

紅花藥用品質主要受紅花種質資源的影響，種質資源遺傳多樣性研究是種質資源利用的基礎[24]。遺傳多樣性最直接的表現形式是遺傳變異水平的高低，包括種群的遺傳分化和遺傳結構[25]。分析不同類型紅花種質的遺傳差異，可為云南紅花種質資源保護、高產以及優質紅花新品種的選育、紅花種質資源的開發與利用奠定基礎[26]。20 世紀80 年代初，有研究報道，菊科紅花在自然狀態下以自花授粉為主，但蜜蜂也可成為紅花的傳粉昆蟲，異交率可達40%以上[27]。本研究中，根據UPGMA 聚類分析，遺傳相似系數為0.64～0.66，把50 份紅花材料分為4 個組，與傳統形態學分類略有不同；同時進行遺傳分化和群體結構分析發現，6 個群體間遺傳分化系數為0.444 5，總基因流為0.624 8，說明紅花種內的變異較大，種內的基因流動較大，不同類型紅花種質群體內及群體間的基因多態性、遺傳分化、基因流等信息均存在較大差異，這與BARATI等[28]和DWIVEDIT 等[29]的研究結果類似。因此，可以說明育種材料之間的基因交流情況揭示育種材料內部的遺傳分化，能夠有效地幫助紅花育種工作者更方便、準確地了解和掌握紅花種質資源間的遺傳關系。在將來育種工作中，研究人員要注意加強紅花種質資源的交流，提高種質資源的遺傳多樣性，擴充我國紅花育種的種質基因庫，為培育紅花雜交親本選擇及新品種選育奠定基礎。

菊科紅花在云南稱滇紅花，為云南省道地藥材之一，產區主要為低海拔低緯度干熱河谷地區，栽培類型多種多樣，但產區間相互引種頻繁，因此，聚類結果與前期研究表型聚類分析、地理區域劃分結果并不一致，略有差別。本研究利用AFLP 標記對50 份云南紅花種質資源的群體結構和遺傳多樣性進行分析，揭示了云南紅花種質資群體遺傳信息以及群體間的基因滲透，對將來紅花育種、親本選擇具有一定的指導意義。