骨化三醇對肺炎支原體肺炎患兒Th17/Treg失衡的干預作用

曹 正 余 蓉 薛 冰 王建榮

肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumonia pneumonia，MPP)是由肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)引起的肺實質和(或)間質的急性感染，約占兒童社區獲得性肺炎的10%～30%[1]。世界范圍內流行病學研究表明，每隔3～7年MP感染會出現周期性社區流行，持續數月到數年不等[2]。部分患兒病情較重，常累及全身多個系統，嚴重影響兒童的身心健康。骨化三醇[1，25(OH)2D3]作為體內維生素D的重要產物，近年來，應用不僅局限于調節鈣磷代謝及內分泌功能，其抗炎、抗感染、免疫調節作用得到廣泛關注[3]。劉金等[4]研究表明，MPP患兒存在維生素D缺乏。杜許芳等[5]研究表明，Th17/Treg失衡參與了MPP的發病過程。邵美琪等[6]報道予以維生素D體外培養哮喘患者外周血單個核細胞，可使Treg 細胞水平升高，Th17 細胞降低。但MPP患兒能否口服維生素D調節Th17/Treg失衡，目前少見相關報道。本實驗擬定以維生素D輔助治療MPP，旨在探索維生素D對Th17/Treg失衡的調節作用及可能存在的機制，為MPP患兒合理補充維生素D改善免疫失衡及臨床癥狀提供理論依據。

對象與方法

1.研究對象：選取2018年9～12月在新疆醫科大學第五附屬醫院兒科病房收治的50例MPP患兒為實驗組，并選取50例健康兒童為對照組，兩組患兒在年齡、性別、BMI方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。實驗組納入標準：50例患兒均符合MPP的診斷標準[7]：病程3～7天，伴咳嗽、發熱；肺部聽診可聞及固定濕性啰音，胸部X線檢查顯示點片狀陰影；血清特異性MP-IgM≥1∶160為陽性。排除標準：①合并肺部其他疾病及多種病原體感染；②合并先天性疾病、免疫缺陷病、營養不良、甲狀腺、肝臟、腎臟疾病及佝僂病；③入院前或病程中需要應用激素及免疫調節劑。實驗組隨機分為維生素D干預組、非維生素D干預組各25例，兩組患兒一般情況及病情嚴重程度比較，差異無統計學意義，均給予常規治療(止咳祛痰藥物靜脈滴注+阿奇霉素口服，所用藥物頻次及廠家相同)，干預組在常規治療基礎上同時口服維生素D制劑(400 IU/次，1次/天，廈門星鯊)治療2周。本研究經醫院倫理學委員會同意，所有參與者受試前均簽署知情同意書。

2.研究方法：納入標準的患兒均于入院第2天及2周后采集清晨空腹血6ml，肝素抗凝，取3～4ml全血加入PBS對倍稀釋，緩慢倒入裝有4ml淋巴細胞分離液的離心管中，離心后取白膜層，3倍體積的PBS將其洗3遍，1640培養基重懸，調整細胞濃度2×106/ml，收集100μl細胞至離心管中，嚴格按說明書步驟依次加入胞內染色沖洗緩沖液(intracellular staining perm wash buffer)、固定緩沖液(fixation buffer)洗滌重懸細胞，加入20μl Th17/Treg細胞抗體，避光孵育0.5h，洗滌后重懸細胞，加入細胞染色緩沖液(cell staining buffer)0.5ml，分別以CD3+/CD4+/IL-17+、CD4+/CD25+/Foxp3設門，上機檢測。分析Th17、Treg細胞的百分率。其余靜脈血靜置2～4h后以3000r/min速率離心15min,分離血清，ELISA法檢測血清中1,25(OH)2D3、IL-17及IL-10水平(美國BD公司)，嚴格按照操作說明進行。

結 果

實驗組患兒1,25(OH)2D3、Treg及IL-10細胞水平均低于對照組兒童，Th17及IL-17高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 實驗組及對照組患兒1，25(OH)2D3、IL-10、IL-17含量及Treg、Th17水平比較

治療前兩組患兒1,25(OH)2D3、Treg、IL-10、Th17及IL-17水平比較，差異無統計學意義(P均>0.05)，具有可比性。干預組治療后1,25(OH)2D3、Treg及IL-10水平較治療前增加(P<0.05)，Th17及IL-17水平較治療前降低(P<0.05)；非干預組治療后1,25(OH)2D3、Treg及IL-10水平較前增加，Th17及IL-17含量降低，但治療前后比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 兩組治療前后1，25(OH)2D3、IL-10、IL-17含量及Treg、Th17水平比較

干預組與非干預組治療效果比較，干預組患兒咳嗽消失時間及喘息消失時間均低于非干預組，差異有統計學意義(P<0.05)。干預組患兒肺部啰音消失時間、體溫正常時間及平均住院時間與非干預組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表3。

表3 兩組患兒治療效果比較天)

討 論

MPP是兒童常見的呼吸道感染性疾病，其發病機制尚不十分明確，研究多傾向于病原對氣道上皮直接破壞和免疫功能引起的損傷，其中免疫紊亂被認為是推動MPP病情進展的關鍵因素[2]。Treg及Th17細胞均由轉化生長因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β) 誘導初始T細胞分化而成，在功能上相互抑制，且在一定情況下可以互相轉化，共同維持免疫狀態的穩定[8]。Treg細胞對免疫細胞具有負性調節作用，通過分泌IL-10、IL-4等效應細胞因子抑制T細胞的活化和增殖，間接發揮免疫抑制功能[9]；Th17則以分泌效應性細胞因子IL-17為特征，誘導中性粒細胞和單核細胞聚集，刺激并釋放大量炎性因子及趨化因子，如IL-8、TNF-α和 IL-1β等，促進和放大炎性反應[10]。

本研究表明，MPP患兒急性期存在Th17/Treg細胞失衡，促炎性細胞Th17升高，抑制炎性細胞Treg降低，與朱章華等[11]研究結果相一致，其機制可能為MP感染后通過黏附蛋白吸附于上皮細胞表面受體，激活并誘導抗原遞呈細胞分泌炎性細胞因子如IL-1β和IL-6等，導致Treg細胞凋亡并向Th17細胞轉化，產生IL-17以發揮其促炎作用，最終Th17/Treg免疫平衡失調，推動了MPP患兒疾病的進展[12]。

維生素D在肺的微環境中發揮重要的免疫調節作用，目前測定血清1，25(OH)2D3評估體內維生素 D 的含量是最準確的方法[13]。本研究納入50 例MPP患兒，檢測出血清中1，25(OH)2D3水平低于對照組，差異有統計學意義，與繆美華等[14]研究結果相一致，考慮體內1，25(OH)2D3缺乏可能是導致兒童MPP發生的潛在病因，其水平降低能引起呼吸道黏膜上皮變性、角化和增生，致使氣道上皮合成并分泌抗菌肽、防御素、單核-吞噬細胞等減少；同時引起B淋巴細胞分化和成熟障礙，免疫球蛋白水平降低，多種因素共同作用下患兒免疫功能出現紊亂，增加了MPP患兒的發病風險[15，16]。

1，25(OH)2D3作為體內最基本的信號分子，通過內分泌的方式聯系細胞外刺激和細胞內基因應答[17]。氣道上皮細胞、單核細胞及樹突狀細胞中均存在維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)的表達，肺部受到感染時，局部組織1，25(OH)2D3合成增加，通過維生素D結合蛋白(vitamin D binding protein,VDBP)運送至細胞核內的VDR，激活并表達一系列抗菌因子調節肺組織局部免疫[18]。Gregori等[19]動物實驗表明維生素 D 可誘導小鼠體內Treg細胞的生成，王茜等[20]報道維生素D可通過抑制Rhoa/Rock信號通路，減少Th17及IL-17的產生。本研究發現，常規治療基礎上給予MPP患兒口服維生素D可提高體內1,25(OH)2D3濃度，有效降低Th17 細胞水平，提高 Treg細胞比例，部分糾正 Th17/Treg 細胞失衡。分析其機制為在幼稚T細胞發育的過程中，1，25(OH)2D3一方面可阻止幼稚樹突狀細胞向成熟樹突狀細胞分化，促進Treg生成并分泌IL-10因子，還可通過IL-17啟動子招募組蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylase,HDAC)，抑制IL-17啟動子募集Runt相關轉錄因子1 (Runx1)來下調IL-17的水平，進而阻抑CD4+T細胞向Th17亞群分化[21，22]。本實驗研究過程中共有3例患兒出現肺不張、胸腔積液等肺內外并發癥，多次調整抗生素并予以地塞米松靜脈滴注，因糖皮質激素具有抑制細胞及體液免疫、抗炎、退熱等功效，為實驗混雜因素，故未納入實驗結果。

研究顯示，IL-17可促進α-平滑肌肌動蛋白和 Rhoa蛋白的表達，導致小氣道廣泛的收縮痙攣，加重氣道反應性[23]。本實驗干預組患兒給予維生素D后咳嗽及喘憋癥狀消失時間較非干預組縮短，考慮維生素D可通過下調IL-17減輕氣道炎性反應，進而改善呼吸道癥狀；干預組患兒體溫恢復正常時間及總住院時間較非干預組縮短，但差異無統計學意義，可能與樣本量較少有關，兩組患兒肺部啰音吸收時間比較差異無統計學意義。IL-17為具有雙向作用的因子，急性感染期機體需要強有力的免疫應答清除病原，此時IL-17在炎性反應部位聚集并發揮其抗感染作用，據此可推測早期感染越重，炎性反應越強烈，IL-17水平越高，在疾病恢復期高水平的IL-17可致炎性損傷不利于疾病轉歸，有研究證實MPP患兒嚴重程度與血清IL-17水平呈正相關[24]。若MPP患兒病情發展至重癥肺炎支原體肺炎(severe MPP,SMPP)，則治療難度較大，能否通過口服維生素D降低IL-17以減少SMPP發病的風險，為今后研究方向。

綜上所述，維生素D輔助治療MPP可在一定程度上調節Th17/Treg失衡并改善呼吸道癥狀。由于本研究樣本量較小、觀察周期較短，需擴大樣本量明確其臨床療效，并規范維生素D的用法、用量，隨著研究的不斷深入，將為MPP的干預和治療提供新的靶點。