活性維生素D拮抗糖尿病胰島β細胞炎癥反應作用機制研究

燕小寧

1.山西中醫藥大學第四臨床學院，山西太原 030619；2.山西省中西醫結合醫院，山西太原 030001

2 型糖尿病為常見的高發內分泌疾病，其發病機制復雜，至今尚未完全明確。近年來，大量研究證實[1]，2 型糖尿病患者機體存在以巨噬細胞浸潤增加為主要特征的胰島炎癥，且對胰島β 細胞正常功能造成極大影響，進而參與2 型糖尿病的發病及發展，并發揮著重要的作用。臨床研究發現[2-3]，活性維生素D 可作為內分泌激素有效調節骨代謝和鈣磷平衡，同時還具有免疫調節功能，延緩和防治自身免疫性糖尿病的疾病進展，同時對胰島組織的炎癥反應水平具有明顯的抑制作用，可有效改善胰島組織損傷及淋巴細胞浸潤進展；為進一步闡明活性維生素D 拮抗糖尿病炎癥反應作用及其作用機制，本研究采用活性維生素D 在體外作用于大鼠胰島β 細胞RINm 細胞株，觀察其對細胞因子引起的胰島β 細胞凋亡及其受損的胰島素分泌的影響，并探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠胰島β 細胞RINm 細胞株購自美國ATCC 公司；干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）均購自美國Thermo 公司，活性維生素 D 購自上海羅氏制藥有限公司（批號：J20100056）；青鏈霉素混合液、高糖改良杜氏伊格爾培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養基、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、胰蛋白酶消化液、胎牛血清（CAS：10099-141）購自美國Gibco 公司，4，5-二甲基噻唑-2（MTT）試劑、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自碧云天生物有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IFN-γ 酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購置美國R&D 公司，一氧化氮（NO）測定試劑盒（酶法）購置南京建成生物研究所。

1.2 方法

（1）細胞培養：RINm 細胞培養于1%青鏈霉素、10%胎牛血清的高糖DMEM 培養液，在37℃、5% CO2培養箱培養，24h 換液1 次；待細胞增殖至80%融合時，采用0.25%胰蛋白酶消化液消化3min 后，以1mL DMEM 完全培養基終止胰酶消化，并用移液器輕吹打使其解離懸浮，以1 ∶3 比例進行傳代。將穩定傳代至第4 ～8 代的RINm 細胞接種于96 孔板和6 孔板，培養24h 后，分為4 組，每個樣本設3 個復孔；對照組：僅使用10%胎牛血清的DMEM溶液進行培養；在對照組培養基礎上，按給藥不同分成3 組，VD 組：給予8mol/L 活性維生素D 培養；IL-1β+IFN-γ 組：給予50pg/mL 的IL-1β 和5ng/mL 的LIFN-γ 培養；IL-1β+IFN-γ+VD 組：給予8mol/L 活性維生素D、IL-1β 和5ng/m 的LIFN-γ 培養；各組CO2培養箱避光培養24h 后，進行以下實驗。（2） MTT檢測：96 孔板培養的RINm 細胞用于MTT 檢測細胞增殖抑制率，于各組細胞中加 MTT 試劑 20μL，繼續培養4h 后，用移液器吸去培養液，再加DMSO 試劑100μL，低速振蕩10min，采用多功能酶標儀于490nm 處檢測吸光度，并計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率（%）=（1- 實驗孔平均OD 值/對照孔平均OD 值）×100%。（3）相關指標檢測 吸取6 孔板培養的RINm 細胞培養液，高速離心取上清液，應用ELISA 法檢測上清液中IL-6、TNF-α、IFN-γ 含量，同時以NO 測定試劑盒采用酶法測定上清液中NO 含量，于530nm 處進行檢測OD 值，并計算NO 含量（μmol/L）=測定管OD/標準管OD×100μmol/L；所有檢測操作嚴格按試劑說明書執行；（4） 胰島素水平檢測。同上方法得上清液，運用化學發光法，采用全自動化學發光免疫分析儀（德國西門子拜耳公司，型號：ADVIA Centaur）進行含量檢測，批間CV 4.1%，批內CV 3.0%。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組RINm細胞增殖的影響分析

給予不同試劑培養后，經MTT 試驗檢測結果顯示，VD 組細胞無明顯抑制作用（t=1.242，P=0.716）；而IL-1β+IFN-γ 組和IL-1β+IFN-γ+VD 組RINm細胞增殖均受到明顯影響（P ＜0.05）；同時，IL-1β+ IFN-γ 組和IL-1β+IFN-γ+VD 組抑制率與VD 組比較均存在顯著差異（P ＜0.05）；且IL-1β+IFN-γ 組抑制率較IL-1β+IFN-γ+VD 組顯著增高（P ＜0.05），見表1。

2.2 各組RINm細胞炎癥指標的影響分析

VD 組RINm 細胞IL-6、TNF-α 及IFN-γ水平與對照組比較，無明顯差異（P ＞0.05）；IL-1β+IFN-γ 組及IL-1β+IFN-γ+VD 組炎癥因子水平均顯著增高（P ＜0.05）；而IL-1β+IFN-γ+VD組IL-6、TNF-α 及IFN-γ 水平較IL-1β+IFN-γ組顯著降低，差異有統計學意義（P ＜0.05），見表2。

表1 各組RINm細胞增殖抑制率比較（）

表1 各組RINm細胞增殖抑制率比較（）

注：t1，P1 為IL-1β+IFN-γ 組 與 對 照 組 比 較；t2，P2 為IL-1β+IFN-γ+VD 組與對照組比較；t3，P3 為IL-1β+IFN-γ 組與VD 組比較；t4，P4 為IL-1β+IFN-γ+VD 組與VD 組比較；t5，P5 為IL-1β+IFN-γ+VD 組與IL-1β+IFN-γ 組比較

組別 OD值 抑制率（%）IL-1β+ IFN-γ組 1.536±0.534abc 47.27±6.84bc IL-1β+IFN-γ+VD組 2.814±0.246ab 23.45±2.15b VD組 3.105±0.084 0.21±0.02對照組 3.338±0.153 -t1 4.351 -P1 0.034 -t2 6.354 -P2 0.027 -t3 5.135 -P3 0.041 -t4 6.075 -P4 0.030 -t5 9.316 -P5 0.010 -

表2 各組RINm細胞IL-6、TNF-α及IFN-γ表達水平比較（

表2 各組RINm細胞IL-6、TNF-α及IFN-γ表達水平比較（

注：t1，P1 為IL-1β+IFN-γ 組 與 對 照 組 比 較；t2，P2 為IL-1β+IFN-γ+VD 組與對照組比較；t3，P3 為IL-1β+IFN-γ 組與IL-1β+IFN-γ+VD 組比較

組別 IL-6（ng/L）TNF-α（ng/L）IFN-γ（pg/mL）IL-1β+IFN-γ組 122.02±18.34 93.79±6.03 49.81±4.47 IL-1β+IFN-γ+VD組 93.07±24.14 68.57±5.98 25.10±2.25 VD組 91.03±25.15 29.86±2.02 18.20±2.05對照組 90.24±26.86 29.84±1.95 15.68±2.29 t1 12.541 23.654 9.648 P1 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 t2 8.654 15.671 6.514 P2 0.031 ＜0.01 0.042 t3 5.625 7.854 4.954 P3 0.034 0.026 0.042

2.3 各組RINm細胞一氧化氮、胰島素水平分析

VD 組RINm 細胞NO 及胰島素水平無明顯變化（P ＞0.05）；IL-1β+IFN-γ 組 及IL-1β+IFN-γ+VD組NO 水平顯著增高，胰島素顯著降低（P ＜0.05）；IL-1β+IFN-γ+VD 組NO 水平明顯低于，胰島素水平明顯高于IL-1β+IFN-γ 組，差異有統計學意義（P ＜0.05），見表3。

表3 各組RINm細胞一氧化氮、胰島素水平比較（）

表3 各組RINm細胞一氧化氮、胰島素水平比較（）

注：t1，P1 為IL-1β+IFN-γ 組 與 對 照 組 比 較；t2，P2 為IL-1β+IFN-γ+VD 組與對照組比較；t3，P3 為IL-1β+IFN-γ 組與IL-1β+IFN-γ+VD 組比較

組別 NO（μmol/L） 胰島素（mU/L）IL-1β+IFN-γ組 31.25±2.75 1.17±0.07 IL-1β+IFN-γ+VD組 20.37±1.63 1.54±0.13 VD組 14.54±1.54 1.87±0.14對照組 13.86±2.12 1.82±0.12 t1 15.624 9.561 P1 ＜0.01 ＜0.01 t2 5.627 4.856 P2 0.034 0.041 t3 4.957 6.624 P3 0.034 0.027

3 討論

統計顯示[4]，2 型糖尿病發病率近年來急速上增高，發病年齡亦趨于年輕化。隨著糖尿病的發病，易引發腎和心器官、神經血管系統、視網膜等諸多系統并發癥的發生，導致器官正常功能損傷和衰竭，甚至致殘或致死[5]。目前，大量研究認為糖尿病是一種慢性低度炎癥疾病，糖尿病患者細胞因子及趨化因子水平增高、免疫細胞浸潤數量增加、胰島組織淀粉樣蛋白沉積等均證實炎癥反應與其發病密切相關[6-9]。胰島β 細胞是引發2 型糖尿病病變的重要細胞，本研究以胰島β 細胞為研究對象，以探討其炎癥機制。

IL-6 和TNF-α 為重要的炎癥因子，并與糖尿病的發病密切相關[10-11]。IL-6 可有效促進超敏C-反應蛋白（hs-CRP）、α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）、C-反應球蛋白等多種急性時相反應蛋白的合成，誘導炎癥及胰島素抵抗發生[12]；同時，IL-6 對胰島β 細胞具有一定的細胞毒性，IL-6 水平增高可抑制胰島β 細胞增殖速度，并誘導凋亡[13]。TNF-α 則可通過抑制胰島素受體底物-1 表達水平，從而抑制其與胰島素受體結合，導致胰島素合成功能降低[14]；另外，TNF-α 還可降低葡萄糖轉運4 蛋白的表達水平，直接引發胰島素抵抗，同時可促進脂質水解，增高游離脂肪酸含量，降低肌細胞糖代謝水平，促進肝糖原合成，間接導致促進胰島素抵抗的發生；閆鏞等[16]發現糖尿病模型大鼠血清TNF-α、IL-6 等炎癥因子水平較正常大鼠顯著增高，且給予藥物治療后，TNF-α、IL-6 水平呈顯著降低。臨床研究發現[17]，2 型糖尿病患者血清TNF-α水平與糖化血紅蛋白呈正相關，而血清IL-6 水平與空腹血糖值呈正相關，二者對2 型糖尿病的臨床療效及患者預后具有較高的預測價值。并且有大量研究發現[18]，糖尿病及胰島素抵抗患者血清TNF-α、IL-6 水平較正常人群顯著增高，而通過糖尿病治療和改善胰島素抵抗后，血清TNF-α、IL-6 水平則呈明顯降低。活性維生素D 為2 型糖尿病臨床治療的常用藥物，取得了顯著療效，但其作用機制研究報道較少。IFN-γ 為導致β 細胞破壞的代表性Th1 細胞因子，同時本研究聯合IL-1β 刺激胰島β 細胞，在體外建立胰島炎細胞模型，觀察活性維生素D 對大鼠胰島β 細胞RINm 細胞株的抗炎作用。

本 研 究 結 果 顯 示，VD 組RINm 細 胞IL-6、TNF-α 及IFN-γ 水平與對照組比較，無明顯差異（P ＞0.05）；IL-1β+IFN-γ 組 及IL-1β+IFNγ+VD 組炎癥因子水平均顯著增高（P ＜0.05）；而IL-1β+IFN-γ+VD 組IL-6、TNF-α 及IFN-γ 水平較IL-1β+IFN-γ 組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），提示IL-1β+IFN-γ 所致的炎癥細胞模型成立，活性維生素D 可有效降低胰島β 細胞IL-6、TNF-α 及IFN-γ 的表達，從而改善細胞炎癥水平；同時，對細胞增殖檢測結果顯示，VD 組細胞無明顯抑制作用；而IL-1β+ IFN-γ 組和IL-1β+IFN-γ+VD組RINm 細胞增殖均受到明顯影響（P ＜0.05）；同時，IL-1β+IFN-γ 組和IL-1β+IFN-γ+VD 組抑制率與VD 組比較均存在顯著差異（P ＜0.05）；且IL-1β+IFN-γ 組抑制率較IL-1β+IFN-γ+VD 組顯著增高（P ＜0.05），提示活性維生素D 可有效促進炎癥胰島β 細胞增殖，且對細胞的增殖無抑制作用，安全性高。推測其原因可能為：活性維生素D 作為生理調節劑，可能通過抑制細胞IL-6、TNF-α 等炎癥因子的表達，降低炎癥因子對胰島β 細胞的刺激，使細胞增殖不受影響，進而保護胰島β 細胞正常功能。值得注意的是，胰島β 細胞正常組亦可檢測低水平的IL-6、TNF-α，研究報道顯示[19]，低水平IL-6 能有效刺激胰島β 細胞產生和合成胰島素，而高濃度IL-6 則會導致胰島β 細胞產生形態變化和功能障礙。由此推測，低水平炎癥因子是維持胰島β 細胞正常功能的生理需求，而炎癥因子水平的增高可抑制其增殖，影響其正常功能。

另外，本研究對胰島β 細胞的一氧化氮、胰島素水平檢測結果顯示，VD 組RINm 細胞NO 及胰島素水平無明顯變化（P ＞0.05）；IL-1β+IFN-γ 組及IL-1β+IFN-γ+VD 組NO 水平顯著增高，胰島素顯著降低（P ＜0.05）；IL-1β+IFN-γ+VD 組NO 水平明顯低于，胰島素水平明顯高于IL-1β+IFN-γ組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；進一步證實，活性維生素D 可有效改善胰島β 細胞炎癥水平，恢復其正常胰島素分泌功能；研究發現[20]，活性維生素D具有一定的免疫調節作用，抑制T 細胞介導的免疫反應；IL-6 等Th1 細胞因子協同IL-1β 等單核巨噬細胞因子可誘導胰島細胞產生炎癥過程的級聯反應，促進NO 合酶合成過量的NO 及氧自由基，導致胰島β 細胞內DNA 斷裂，進而影響其結構及功能破壞；同時，IL-6、TNF-α 等炎癥因子可引起胰島素抵抗，刺激導致各種細胞因子分泌，降低胰島素受體的活性，最終導致胰島素量合成降低；活性維生素D可有效降低IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達水平，從而改善胰島β 細胞正常分泌功能。

綜上所述，活性維生素D 可有效降低糖尿病胰島β 細胞炎癥反應水平，保護胰島β 細胞正常分泌功能，為活性維生素D 的臨床應用提供參考。