D5、D6優(yōu)質(zhì)囊胚移植和冷凍策略研究*

陳清汾，康躍凡，林典梁，杜生榮

福建省婦幼保健院(福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)生殖醫(yī)學(xué)中心(福州 350001)

隨著囊胚培養(yǎng)和玻璃化冷凍技術(shù)的不斷完善，選擇性單囊胚移植已經(jīng)日益成為趨勢(shì)，尤其是凍融周期單囊胚移植，既可保證較高的妊娠率的同時(shí)，還能減少多胎妊娠的發(fā)生[1-2]。但是當(dāng)前對(duì)凍融周期選擇性單囊胚移植還缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。有學(xué)者認(rèn)為優(yōu)質(zhì)的D5囊胚可行單囊胚冷凍復(fù)蘇和移植[3,6]。那么為減少反復(fù)凍融對(duì)胚胎造成的損害，必然需要將所有優(yōu)質(zhì)D5囊胚施行單胚冷凍。既增加胚胎冷凍保存所需的時(shí)間和費(fèi)用，還會(huì)占用大量的冷凍空間。因此D5囊胚的冷凍策略成為了一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。另外，文獻(xiàn)報(bào)道D6囊胚的妊娠率和種植率明顯低于D5囊胚[4-5]，優(yōu)質(zhì)D6囊胚冷凍和移植策略也是本研究討論的一個(gè)問(wèn)題。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 回顧性分析2015年1月至2017年10月于福建省婦幼保健院生殖中心實(shí)施凍融周期至少一個(gè)優(yōu)質(zhì)囊胚移植的患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：女方取卵年齡<38歲；首次行D5或D6至少一個(gè)優(yōu)質(zhì)囊胚移植。排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮畸形、子宮肌腺癥、子宮內(nèi)膜異位癥以及PGD凍融周期患者。根據(jù)移植的囊胚數(shù)、囊胚等級(jí)和囊胚的發(fā)育速度分為D5單優(yōu)質(zhì)囊胚組(D5-SHBT，822個(gè)移植周期)、D5雙優(yōu)質(zhì)囊胚組(D5-DHBT，503個(gè)移植周期)、優(yōu)和非優(yōu)D5囊胚組(D5-H & PBT，116個(gè)移植周期)、D6單優(yōu)質(zhì)囊胚組(D6-SHBT，210個(gè)移植周期)、D6雙優(yōu)質(zhì)囊胚組(D6-DHBT，94個(gè)移植周期)、優(yōu)和非優(yōu)D6囊胚組(D6-H & PBT，119個(gè)移植周期)。

2 研究方法

2.1 囊胚培養(yǎng)及評(píng)分：常規(guī)行控制性促排卵，經(jīng)常規(guī)體外受精(In vitro fertilization，IVF)或卵泡漿內(nèi)單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)進(jìn)行受精。待胚胎發(fā)育至第3天時(shí)，挑選可用于冷凍或移植的胚胎1～2個(gè)，其余正常受精的胚胎置于G2培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，將達(dá)到冷凍標(biāo)準(zhǔn)的胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍保存。參照Gardner 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)囊胚的擴(kuò)張程度，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞層的質(zhì)量對(duì)D5和D6囊胚進(jìn)行評(píng)分。若囊胚在3期以上，且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或滋養(yǎng)細(xì)胞層在B級(jí)以上則予以冷凍保存。如果內(nèi)細(xì)胞團(tuán)/滋養(yǎng)細(xì)胞層評(píng)分均在B級(jí)以上(≥3BB)評(píng)為優(yōu)質(zhì)囊胚。本研究納入的凍融移植周期均為至少含有一個(gè)優(yōu)質(zhì)囊胚的單囊胚或雙囊胚移植。

2.2 囊胚冷凍及復(fù)蘇:所有囊胚均采用玻璃化冷凍及凍融的方法進(jìn)行，冷凍及凍融的操作按玻璃化冷凍、解凍試劑盒(COOK，澳大利亞)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。移植當(dāng)天解凍囊胚，經(jīng)激光輔助孵化后，置于G2培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)于COOK培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，觀察囊胚的擴(kuò)張情況。

2.3 內(nèi)膜準(zhǔn)備與囊胚移植:患者采用人工周期或是自然周期備子宮內(nèi)膜。在黃體酮注射5～6 d后或排卵5～6 d后進(jìn)行超聲引導(dǎo)下的囊胚移植。胚胎移植術(shù)后14 d可驗(yàn)?zāi)蚧虺檠棣?hCG證實(shí)是否妊娠，妊娠6～7周，B超檢查確定是否臨床妊娠。

2.4 臨床結(jié)局評(píng)價(jià)指標(biāo):臨床臨床妊娠率(%)=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；種植率(%)=孕囊數(shù)/移植囊胚數(shù)×100%；流產(chǎn)率(%)=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；多胎率(%)=超過(guò)1個(gè)孕囊的妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；早產(chǎn)率(%)=妊娠28～小于37足周的周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率(%)=分娩胎兒的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

結(jié) 果

1 凍融周期D5-SHBT、D5-DHBT和D5-H & PBT妊娠結(jié)局比較 D5-SHBT、D5-DHBT和D5-H & PBT三組患者的平均年齡、子宮內(nèi)膜厚度和子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方式比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組流產(chǎn)率之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而種植率、臨床妊娠率、多胎率、早產(chǎn)率和活產(chǎn)率組間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)：其中D5-DHBT臨床妊娠率顯著高于D5-SHBT(P<0.014)，D5-H & PBT臨床妊娠率與D5-DHBT、D5-SHBT比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.014)；D5-SHBT種植率顯著高于D5-H & PBT(P<0.014)，其余兩組種植率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.014)； D5-DHBT和D5-H & PBT多胎率均顯著高于D5-SHBT(均P<0.014)，D5-DHBT和D5-H & PBT多胎率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.014)；D5-DHBT早產(chǎn)率均顯著高于D5-H & PBT和D5-SHBT(均P<0.014)，D5-H & PBT和D5-SHBT早產(chǎn)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.014)；D5-DHBT活產(chǎn)率顯著高于D5-SHBT(P<0.014)，其余兩組活產(chǎn)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2 凍融周期D6-SHBT、D6-DHBT和D6-H & PBT妊娠結(jié)局比較 D6- SHBT、D6-DHBT和D6-H & PBT三組患者平均年齡、子宮內(nèi)膜厚度和子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方式比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組種植率、流產(chǎn)率和早產(chǎn)率之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組臨床妊娠率、多胎率和活產(chǎn)率組間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中D6-DHBT和D6-H & PBT臨床妊娠率、多胎率及活產(chǎn)率均顯著高于D6-SHBT(均P<0.014)，D6-DHBT臨床妊娠率、多胎率及活產(chǎn)率和D6-H & PBT比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.014)。見(jiàn)表2。

3 D5和D6單、雙優(yōu)質(zhì)凍融囊胚移植周期的妊娠結(jié)局比較 D5-SHBT、D5-DHBT、D6-SHBT和D6-DHBT四組患者平均年齡、子宮內(nèi)膜厚度和子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方式比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組流產(chǎn)率之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而種植率、臨床妊娠率、多胎率、早產(chǎn)率和活產(chǎn)率組間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.008)。其中D5-DHBT臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著高于D6-SHBT和D6-DHBT(均P<0.008)；D5-SHBT臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著高于D6-SHBT(均P<0.008)，但與D6-DHBT比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.008)；D5組種植率均顯著高于D6組(均P<0.008)；雙優(yōu)質(zhì)囊胚移植組的多胎率均顯著高于單優(yōu)質(zhì)囊胚移植組(均P<0.008)，D5-DHBT多胎率顯著高于D6-DHBT(P<0.008)；D6-DHBT早產(chǎn)率顯著高于D5-SHBT(P<0.008)，D5-DHBT早產(chǎn)率顯著高于D6-SHBT(P<0.008)。見(jiàn)表3。

表1 D5-SHBT、D5-DHBT和D5-H & PBT妊娠結(jié)局比較

表2 D6-SHBT、D6-DHBT和D6-H & PBT妊娠結(jié)局比較

表3 D5和D6單、雙優(yōu)質(zhì)凍融囊胚移植周期妊娠結(jié)局比較

討 論

輔助生殖技術(shù)首要目標(biāo)是保證健康、足月的單胎妊娠，同時(shí)還要減少多胎妊娠的發(fā)生。而選擇性單囊胚移植已經(jīng)成為滿(mǎn)足IVF目標(biāo)的重要手段，尤其是凍融周期選擇性單囊胚移植，由于其子宮內(nèi)膜的同步性較好，可獲得更高的累計(jì)妊娠率和活產(chǎn)率[2]。但是，我國(guó)目前對(duì)D5和D6囊胚能否行單囊胚移植及其相應(yīng)的冷凍方案沒(méi)有相關(guān)的指南或規(guī)定。鑒于囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分和發(fā)育速度皆是影響妊娠成功的獨(dú)立因素，針對(duì)不同評(píng)分和發(fā)育速度的囊胚其移植和冷凍方案也應(yīng)有所區(qū)別[7,11]。

對(duì)于凍融周期D5囊胚移植，多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為移植D5雙囊胚的種植顯著低于移植D5單囊胚，且移植D5雙囊胚的多胎率顯著高于移植D5單囊胚，由此建議D5囊胚可行單囊胚移植[3,6]。但上述研究并未對(duì)移植D5單優(yōu)質(zhì)囊胚和D5雙優(yōu)質(zhì)囊胚的臨床結(jié)局作比較，更沒(méi)有針對(duì)移植D5優(yōu)質(zhì)和非優(yōu)質(zhì)兩個(gè)囊胚的臨床結(jié)局的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。廖宏慶等的研究雖然對(duì)凍融周期選擇性D5單優(yōu)質(zhì)囊胚和D5雙優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠率、種植率和多胎率作了比較，但并未涉及活產(chǎn)率和早產(chǎn)率的研究[8]。

本研究對(duì)凍融周期移植一個(gè)以上優(yōu)質(zhì)D5囊胚患者的臨床結(jié)局作了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與D5-DHBT相比，D5-SHBT臨床妊娠率和活產(chǎn)率均較低(均P<0.014)，但是其多胎率和早產(chǎn)率也明顯降低(均P<0.014)，這與Devine等的報(bào)道一致[9]。Devine等還證實(shí)D5-SHBT可獲得更高的累計(jì)妊娠率和活產(chǎn)率[9]。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)，D5-H & PBT雖獲得與D5-DHBT相近的臨床妊娠率和活產(chǎn)率(均P>0.014)，并可顯著降低早產(chǎn)率(P<0.014)，但是其多胎率依然顯著高于D5-SHBT(P<0.014)。因此，D5-SHBT仍是降低多胎妊娠的最有效的方法。

為減少反復(fù)凍融對(duì)胚胎造成的損害，凍融周期行選擇性單囊胚移植必然需要將所有優(yōu)質(zhì)D5囊胚施行單胚冷凍。這既增加了冷凍和保存的費(fèi)用和時(shí)間，還使得胚胎存儲(chǔ)所需空間成倍增長(zhǎng)。因此如何在保證有足夠的胚胎用于單囊胚移植的同時(shí)，還能減少冷凍的空間是我們需要考慮的問(wèn)題。值得注意的是D5-H & PBT分析結(jié)果給了我們一個(gè)啟發(fā)，D5-H & PBT可獲得與D5-DHBT相近的臨床妊娠率和活產(chǎn)率(均P>0.014)，還可以一定程度上降低多胎率(P=0.028)，并顯著降低早產(chǎn)率(P<0.014)的發(fā)生。因此，建議年齡小于38歲患者可冷凍1～2管單個(gè)優(yōu)質(zhì)D5囊胚用于凍融周期單囊胚移植，其余行優(yōu)和非優(yōu)囊胚組合冷凍的方法。若患者移植一至兩管優(yōu)質(zhì)D5囊胚還未妊娠，之后再施行D5-H & PBT可以在保證較高妊娠率的同時(shí)也能在一定程度上減少多胎妊娠和早產(chǎn)的發(fā)生，更能減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)并減少胚胎冷凍所需空間。

另外對(duì)于D6囊胚行凍融周期單囊胚移植，國(guó)內(nèi)外的報(bào)道仍存在較多的分歧。Tubbing等的研究發(fā)現(xiàn)D5囊胚的臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著高于D6囊胚，移植D5囊胚更易獲得成功妊娠[10]。而Kaye等報(bào)道玻璃化冷凍解凍的D6囊胚的臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率與D5囊胚不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)年齡小于35歲的女性同樣可行單囊胚移植[12]。另外Yang等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的D5和D6囊胚可獲得相近的妊娠率和種植率，而低質(zhì)量的D5囊胚的妊娠率顯著高于同質(zhì)量的D6囊胚，并推測(cè)D5和D6囊胚妊娠結(jié)局的差異主要取決于低質(zhì)量的囊胚。因此本研究對(duì)凍融周期移植D5和D6單、雙優(yōu)質(zhì)囊胚的妊娠結(jié)局作了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D5-DHBT臨床妊娠率、種植率和活產(chǎn)率都明顯高于D6-DHBT(均P<0.008)，且D5-SHBT臨床妊娠率、種植率和活產(chǎn)率也都明顯高于D6-SHBT(均P<0.008)，這與Desai的研究結(jié)果是一致的[7,14]。由此推測(cè)，囊胚的發(fā)育速度是預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的一個(gè)重要因子。

雖然D6-DHBT仍維持較高的多胎率，但是已經(jīng)明顯低于D5-DHBT(P<0.008)。考慮到D6-DHBT可獲得與D5-SHBT相近的臨床妊娠率(P>0.008)，而D6-SHBT的臨床妊娠率、活產(chǎn)率并不理想，顯著低于D6-DHBT和D6-H & PBT(P<0.014)，因此建議D6囊胚施行雙囊胚移植(D6-DHBT或D6-H & PBT)和冷凍，可獲得較高的妊娠率，至于如何避免多胎風(fēng)險(xiǎn)還有待進(jìn)一步的探討。