亞麻籽膠對兒茶素-肌原纖維蛋白熱誘導凝膠特性的影響

賈 娜，張風雪，孫 嘉，宋 立，劉登勇*

（渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

肌原纖維蛋白是肌肉蛋白質的主要成分，是一種具有功能特性的蛋白質，除維持肌纖維的形狀、參與肌肉的收縮外，其熱誘導凝膠還對肉制品的硬度、彈性和保水性等方面有重要影響[1]。蛋白質在加工、貯藏、運輸等過程中會發生氧化，是除微生物污染、脂肪氧化之外影響肉品品質的又一重要因素，有研究表明，通過加入多酚類天然抗氧化劑可抑制肉類蛋白質的氧化程度[2-3]。但是，多酚在發揮其抗氧化作用的同時，還能與蛋白質以非共價或共價方式發生相互作用[4]。其中非共價相互作用是可逆的，主要包括多酚與蛋白質分子間的氫鍵、疏水相互作用和范德華力等[5]；共價作用是不可逆的，如高濃度的綠茶提取物能與豬肉肌原纖維蛋白中的巰基發生共價交聯，生成巰基-醌加成物，從而阻止了蛋白質之間交聯形成二硫鍵[6]。多酚與蛋白質之間的相互作用一方面會改變蛋白質的結構，另一方面會對蛋白質的功能特性產生不利影響。如高濃度的綠原酸能夠削弱肌原纖維蛋白的凝膠性能[7]；1.25 mmol/L的迷迭香酸能夠阻斷肌原纖維蛋白的巰基交聯，破壞蛋白質凝膠化，使其保水能力和凝膠強度降低[8]。因此，有必要研究在以多酚為抗氧化劑的同時如何減輕其對蛋白質功能特性的不利影響。

食品工業中常添加具有乳化、增稠、保水等性質的親水膠體（如黃原膠、魔芋膠等）改善肉制品的品質。其中亞麻籽膠是一種具有弱凝膠性、乳化性、親水性等性質的天然親水膠體[9]。研究表明，亞麻籽膠可增強肌原纖維蛋白體系中的靜電作用，顯著提高肌原纖維蛋白凝膠保水性[10]，且其濃度越高，凝膠硬度越大[11]。在較高的pH值下，亞麻籽膠還可以降低凝膠速率，有助于形成細密的凝膠網絡，提高凝膠強度[12]。前期研究發現，具有較強抗氧化作用的天然抗氧化劑兒茶素降低了肌原纖維蛋白的凝膠性能。因此，在此基礎上，本研究向兒茶素-肌原纖維蛋白體系中添加亞麻籽膠，研究不同含量的亞麻籽膠對蛋白凝膠特性及二級結構的影響，探究亞麻籽膠能否改善兒茶素對蛋白凝膠特性的不利影響，以期為擴大多酚類物質在肉制品中的應用提供理論基礎和應用指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬背最長肌（宰后24～48 h）購于當地超市。

亞麻籽膠為國產食品級；氯化鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、乙醇、戊二醛、叔丁醇等試劑均為國產分析純；兒茶素 上海Aladdin化學公司。

1.2 儀器與設備

FE20 pH計、JB/7534電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T25數顯型均質機 德國IKA集團；HHS電熱恒溫水浴鍋 山西省文水醫療器械廠；LabRAM HR Evolution共焦拉曼光譜儀 堀場（中國）貿易有限公司；S-4800場發射掃描電鏡 日本日立公司；低場核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；TA-XT2i質構儀 英國Stable Micro Systems公司；Discovery DHR-1流變儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取和樣品的制備

肌原纖維蛋白提取：按照Park等[13]的方法進行并適當修改。稱取適量豬肉樣品，加入4 倍體積的冰提取液（0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二胺四乙酸、6.1 mmol/L Na2HPO4、3.9 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0），勻漿60 s，3 500 r/min、4 ℃冷離心15 min，去上清液重復勻漿離心2 次，得到粗纖維蛋白沉淀；然后加入4 倍體積的冰洗液，勻漿60 s，在3 500 r/min冷凍離心15 min（4 ℃），去上清液重復勻漿離心1 次，得到粗纖維蛋白沉淀，再加4 倍體積冰洗液，勻漿60 s后用4 層紗布過濾，并用0.1 mol/L HCl溶液調pH值為6.0，隨后3 500 r/min冷凍離心15 min（4 ℃），得到的沉淀置于塑封袋中4 ℃保存備用。

樣品制備：將上述所得蛋白質稀釋到20 mg/mL，加入0、50、100 μmol/g的兒茶素，然后加入0.1%～0.4%的亞麻籽膠，混合均勻，得到所需蛋白質溶液混合體系。

1.3.2 熱誘導凝膠的制備

將配制好的蛋白質溶液裝入密閉的玻璃瓶中（30 mm×50 mm），每組3 個平行，放入恒溫水浴鍋內72 ℃保持20 min，制備好的凝膠在室溫下放置2 h后，放入4 ℃的冰箱過夜備用。在進行凝膠特性分析之前要從冰箱中取出放在室溫（25～27 ℃）30 min。

1.3.3 凝膠強度的測定

肌原纖維蛋白凝膠質構特性的測定采用TA-XT plus型質構分析儀。質構分析儀采用的參數如下：測定模式選擇下壓距離，測試前速率為1 mm/s，測試中速率為2 mm/s，測試后速率為1 mm/s，下壓距離為凝膠高度的5 mm，引發力為5 g，探頭型號選擇P/0.5。將待測樣品置于測定平臺上固定好，在室溫下進行測定，每組樣品進行3 次平行實驗，取平均值。

1.3.4 凝膠保水性的測定

采用Salvador等[14]的方法測定凝膠保水性，并適當修改。準確稱取離心管的質量，記為m0，取一定質量凝膠（5～10 g）放入離心管底部，準確稱取此時離心管的質量，記為m1。4 ℃、3 000 r/min離心10 min，離心后小心用中性濾紙吸干離心管中凝膠析出的水分，再次準確稱取離心管質量，記為m2。每組樣品進行3 次平行實驗，取平均值。計算公式如下：

1.3.5 低場核磁的測定

采用Bertram等[15]方法，并適當修改。利用低場核磁共振分析儀分析蛋白質的水合特性，通過研究蛋白質和水分中H1質子相互交換和遷移的規律，以表征蛋白質的水合特征。

樣品的預處理：取約1.5 g處理好的肌原纖維蛋白于色譜瓶中，然后將其放入水浴鍋中72 ℃加熱20 min，隨后取出室溫放置2 h后放入4 ℃冰箱中過夜，測試之前室溫放置30 min。

測試條件：質子共振頻率為22 MHz，測量溫度為32 ℃。首先確定測試參數為：重復掃描8 次，重復間隔時間TR為6 500 ms，采樣間隔80 μs，回波個數12 000。每個樣品平行測定6 次，實驗重復3 次。

1.3.6 動態流變的測定

用Discovery DHR-1流變儀測定樣品的動態學特性。首先將制備好的蛋白質溶液均勻涂布于測試平臺，趕走氣泡。測試參數為：頻率0.1 Hz，應變力2%，上下夾縫1 mm，起始溫度20 ℃，升溫速率2 ℃/min，終止溫度80 ℃。測定過程中，避免平板外蛋白與空氣接觸，蓋上保護蓋，用石蠟進行密封。每組3 個重復。測定指標為流變的彈性模量G’。

1.3.7 拉曼光譜的測定

拉曼光譜通過LabRAM HR Evolution共焦拉曼光譜儀測量，所使用功率約為100 mW，儀器用單晶硅進行頻率校正，用50 倍長焦距鏡頭將激光聚焦到放于載玻片的凝膠樣品上。光譜的獲得條件為：狹縫200 μm，600 g/mm光柵，3 次掃描，積分時間30 s，分辨率2 cm-1，數據獲取速度120 cm-1/min，獲取的拉曼光譜在400～3 600 cm-1。每個樣品測試3 次。測試完成后用儀器自帶的軟件Labspec對光譜進行平滑，多點基線校正去除熒光背景。取800～1 800 cm-1進行分析。根據苯丙氨酸環在1 001 cm-1伸縮振動強度作為內標進行歸一化（其強度不隨蛋白質結構變化而變化）。采用Alix等[16]的方法計算蛋白質不同二級結構（α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲）的含量。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 亞麻籽膠對兒茶素-肌原纖維蛋白凝膠強度和保水性的影響

從圖1a可以看出，當不添加亞麻籽膠只添加兒茶素時，蛋白的凝膠強度高于對照組（P＜0.05），兒茶素含量增加，凝膠強度略有降低，但差異不顯著（P＞0.05）；而圖1b中，當不添加亞麻籽膠時，兒茶素含量增加使凝膠保水性降低，且均顯著低于對照組（P＜0.05），因此，總體來說，兒茶素對蛋白質的凝膠特性有不利影響。魏小紅[17]在研究兒茶素對魚糜凝膠特性的影響時，發現添加一定量的兒茶素會提高鏈魚魚糜的蒸煮損失率，降低魚糜凝膠的品質，這與本研究一致。從圖1a可以看出，不添加兒茶素時（0 μmol/g），不同添加量的亞麻籽膠對凝膠強度無顯著影響（P＞0.05）；兒茶素含量為50 μmol/g和100 μmol/g時，隨著亞麻籽膠添加量的增加，凝膠強度先上升后下降，說明有兒茶素存在時，較低含量的亞麻籽膠可以增強凝膠強度，而較高含量則會降低凝膠強度，可能是因為過量的亞麻籽膠阻礙了蛋白之間的交聯，使凝膠形成受到影響。這與Feng Meiqin等[18]在不同NaCl濃度下研究亞麻籽膠-蛋白復合凝膠的凝膠強度得出的結論一致。由圖1b可以看出，向兒茶素-肌原纖維蛋白體系中添加亞麻籽膠能夠使凝膠保水性也增強，且添加量越高，增加幅度越大，這可能是因為亞麻籽膠可以結合肌原纖維蛋白的氫鍵，抑制蛋白的降解，進而提高凝膠的持水能力。

圖1 亞麻籽膠對兒茶素-肌原纖維蛋白凝膠強度（a）和凝膠保水性（b）的影響Fig. 1 Effects of flaxseed gum on gel strength (a) and water holding capacity (b) of catechins-myofibrillar protein

此外，從圖1還可以看出，當添加0.1%～0.4%亞麻籽膠時，兒茶素含量為100 μmol/g時蛋白的凝膠強度和保水性均高于50 μmol/g，說明兒茶素含量較高時，添加亞麻籽膠改善蛋白凝膠強度和保水性的效果更明顯，這可能是因為亞麻籽膠本身能形成強大的網絡結構[19]，與兒茶素-蛋白互作后的網絡結構交織，不但使凝膠強度顯著增強，且將水分子籠絡在網絡結構中，增強了對水分的束縛力，從而也提高凝膠的保水性能。這與陳海華等[20]在研究亞麻籽膠與鹽溶性肉蛋白作用過程中蛋白凝膠強度和保水性的變化規律一致。

2.2 亞麻籽膠對兒茶素-肌原纖維蛋白凝膠水合特性的影響

肌原纖維蛋白凝膠低場核磁衰減曲線擬合的弛豫時間T2分布為4 個峰，分別對應結合水、不易流動水和自由水3 種形態水。其中T2b（0～10 ms）表示蛋白質分子表面的極性基團與水分子緊密結合的水分子層，也稱為結合水。T21（10～100 ms）和T22（100～1 000 ms）表示存在于肌纖絲及肌原纖維之間的不易流動水，占總水分的80%左右，T23（＞1 000 ms）表示存在于細胞外的間隙中能自由流動的水[21]。弛豫時間可以表明水分的自由度[22]，弛豫時間越短水分越不易流動，弛豫時間越長流動性越高。由于結合水含量一般不受影響，因此本實驗對T2b不做討論。

表1 亞麻籽膠對兒茶素-肌原纖維蛋白凝膠弛豫時間T2的影響Table 1 Effect of flaxseed gum on relaxation time T2 of catechins-myo fi brillar protein gel

由表1可以看出，未添加兒茶素時（0 μmol/g），所有凝膠的弛豫時間均小于1 000 ms，此時不含自由水；兒茶素含量為50 μmol/g時，凝膠開始出現自由水，加入0.1%亞麻籽膠后凝膠仍含自由水，但其弛豫時間縮短（P＜0.05），亞麻籽膠添加量增加至0.2%～0.4%時，自由水消失；兒茶素含量為100 μmol/g時，不管是否添加亞麻籽膠，所有凝膠均含自由水，但弛豫時間均低于僅添加100 μmol/g兒茶素的實驗組凝膠。以上結果說明兒茶素含量增加使凝膠束縛水的能力降低；而隨著亞麻籽膠添加量的升高，凝膠束縛水的能力又逐漸上升，這與凝膠保水性的結果一致。這可能是因為亞麻籽膠帶負電荷的羧基基團和蛋白質中帶正電團的氨基酸側鏈發生相互作用引起的[23]。

弛豫峰比例的變化情況可以反映不同狀態下水分群的相對含量，從而可以評估出不同狀態下水分群遷移情況[24]。表2表示兒茶素含量分別為0、50 μmol/g和100 μmol/g時，不同添加量亞麻籽膠對凝膠弛豫峰比例分步P2的影響，所有凝膠的不易流動水均占絕大部分，這是因為在加熱的作用下，肌原纖維蛋白質分子發生變性，經分子間和分子內相互作用發生交聯聚集，然后再與體系中的水通過化學鍵合而形成凝膠三維空間網絡結構，此時體系中的大部分自由水吸附填充在凝膠網絡結構中，轉變為不易流動水[25]。在不添加亞麻籽膠時，從P22可以看出，隨著兒茶素含量的升高，不易流動水含量也隨之減少，說明兒茶素的加入使凝膠束縛水的能力降低。未添加兒茶素時（0 μmol/g），加入亞麻籽膠使P21顯著升高（P＜0.05），說明亞麻籽膠的加入提高了體系固定自由水的能力，熱誘導過程中更多的水分被束縛在凝膠網絡結構中，提高了不易流動水比例，從而增強凝膠保水性；兒茶素含量為50 μmol/g、亞麻籽膠添加量較低時，兒茶素發揮主要作用，此時水分的自由活度較高，但隨著亞麻籽膠添加量的升高，自由水消失，不易流動水逐漸增加；在兒茶素含量為100 μmol/g時，自由水含量明顯增加，但不易流動水仍占大部分，說明雖然兒茶素降低了凝膠束縛水的能力，但此時仍能形成完整的凝膠結構。綜上所述，隨著兒茶素含量的升高，凝膠自由水活度升高，與凝膠保水性結果一致；而加入亞麻籽膠后，可提高凝膠束縛水的能力，但隨著兒茶素含量的升高，改善效果有所降低。

表2 亞麻籽膠對兒茶素-肌原纖維蛋白凝膠峰比例分步P2的影響Table 2 Effect of flaxseed gum on peak area ratio P2of catechinsmyo fi brillar protein gel

2.3 亞麻籽膠對兒茶素-肌原纖維蛋白流變特性的影響

儲能模量G’又稱彈性模量，反映樣品的彈性，蛋白凝膠的G’越大則表示彈性越好。由圖2可以看出，不添加兒茶素和亞麻籽膠的肌原纖維蛋白凝膠呈現典型的“幾”字形，溫度從20 ℃升高到50 ℃時，G’達到峰值，G’增大來自于肌球蛋白頭部的接合[26]，在此階段，松散的凝膠結構初步形成；隨著溫度的進一步升高，在溫度為50～60 ℃時，G’下降，是由于肌球蛋白尾部逐漸展開，導致形成的半凝膠流動性大幅度增加，從而導致已形成的網絡結構被破壞[27]；在溫度為60～80 ℃之間，G’快速增加，主要原因是溫度升高使肌球蛋白分子展開，蛋白質結構發生變化，引起蛋白質聚集和進一步交聯，由半溶膠轉變為彈性膠體，同時將具有黏彈性的溶膠狀態的蛋白轉變為具有彈性的凝膠網絡結構[28]。從圖4可以看出，隨著兒茶素含量的升高，凝膠形成的能力越來越弱，尤其是100 μmol/g時，流變曲線40～50 ℃的峰值幾乎消失。從圖4a可以看出，僅添加亞麻籽膠時，G’在溫度20～40 ℃范圍內明顯升高，這可能是亞麻籽膠與蛋白間的靜電相互作用使得凝膠體系的彈性增加；并且此時肌原纖維蛋白的熱變性溫度提高了大約2 ℃，這可能是因為亞麻籽膠的親水性能更好，在溶液加熱過程中亞麻籽膠先充分展開，蛋白質分子的展開受到了阻礙，因此推遲了蛋白質的變性[19]。而從圖4b、c可以看出，當加入兒茶素后，再添加亞麻籽膠對20～40 ℃范圍內G’的影響較小。在凝膠形成后期，隨著亞麻籽膠添加量的上升，G’逐漸增大，亞麻籽膠添加量為0.4%時達到最大，說明亞麻籽膠添加量的增加有利于最終形成較好的的凝膠網絡結構，這可能是亞麻籽膠通過分子間作用力或者物理填充、包埋等方式，參與凝膠的形成。

相位角（tanδ）是損耗模量G’’與儲能模量G’的比值，代表樣品的總體黏彈性。tanδ值可以揭示凝膠網狀結構的特性：tanδ越低說明形成的凝膠三維網狀結構越好；反之，則說明網狀結構較差[29]。如圖4所示，溫度在20～50 ℃左右時，蛋白凝膠的tanδ值逐漸增大，即黏性特征優于彈性特征的變化，可能由于在一定剪切強度下，蛋白質無序狀態的分子趨向有序狀態變化，因而黏度特征的變化趨勢優于彈性特征的變化。在溫度為50 ℃左右時產生一個拐點，這是由肌球蛋白變性引起的，肌球蛋白在凝膠網狀結構的形成過程中發揮極其重要的作用[30]。溫度在50～80 ℃時，曲線呈現下降至趨于平緩的趨勢，此時彈性特征優于黏性特征，說明逐漸形成了彈性較好的三維網狀凝膠結構。從圖4還可以看出，加入亞麻籽膠后，在溫度為20～50 ℃時，隨著亞麻籽膠添加量的升高，tanδ值逐漸增加，說明凝膠的黏性升高，而彈性降低，此時并未形成完整的凝膠結構，以溶膠為主；升溫結束后，所有處理組均形成了較好的凝膠結構，差異不明顯。

圖2 亞麻籽膠對兒茶素-肌原纖維蛋白流變特性的影響Fig. 2 Effect of flaxseed gum on rheological characteristics of catechins-myofibrillar protein gel

2.4 亞麻籽膠對兒茶素-肌原纖維蛋白凝膠二級結構的影響

在拉曼光譜中，蛋白質肽鍵（—CO—NH—）有幾個特征振動模式：1 650 cm-1附近的酰胺I帶和1 250 cm-1的酰胺III帶，這兩種條帶在拉曼光譜中很容易辨認，峰的精確位置與蛋白質多肽鏈的二級結構有關，因此經常被用來估計蛋白質的二級結構[31]。加入亞麻籽膠和兒茶素后所形成的蛋白凝膠的拉曼光譜圖見圖3，可以看出經過不同處理后，1 650 cm-1附近的酰胺I和1 250 cm-1附近的酰胺III區域的蛋白質條帶有所不同。酰胺I帶主要包括3 個結構域：1 658～1 654 cm-1表示α-螺旋；1 680～1 665 cm-1表示β-折疊；1 665～1 660 cm-1表示無規卷曲[32]。通過酰胺I帶可以進行蛋白質二級結構分析，定量分析結果見表3。

如表3所示，當不添加亞麻籽膠時，隨著兒茶素含量的升高，凝膠中的α-螺旋減少，β-折疊增加。蛋白質多肽鏈的羰基氧和氨基氫形成的氫鍵維持蛋白的α-螺旋[33]，因此加入的兒茶素與蛋白質羰基或者氨基的相互作用可能會降低多肽鏈之間形成氫鍵的能力[34]，從而導致α-螺旋含量降低。當加入不同含量的亞麻籽膠后，α-螺旋的含量均增加，β-折疊、β-轉角和無規卷曲均降低，說明亞麻籽膠的加入促進蛋白質分子間氫鍵的形成，α-螺旋是最終形成凝膠中的主要結構[35]；當兒茶素含量為0 μmol/g和100 μmol/g、亞麻籽膠添加量為0.1%～0.3%時，隨著亞麻籽膠添加量的升高，α-螺旋逐漸降低，β-折疊和無規卷曲增加，這可能是因為亞麻籽膠與肌原纖維蛋白間的靜電相互作用使蛋白溶液的α-螺旋展開，在形成凝膠時轉變為β-折疊、無規卷曲。這與潘麗華等[9]在研究不同溫度下亞麻籽膠對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響時，蛋白質二級結構的變化一致。

圖3 不同處理組凝膠的拉曼光譜圖（800～1 800 cm-1）Fig. 3 Raman spectra of catechins-myo fi brillar protein with different amounts of flaxseed gum added

表3 亞麻籽膠對兒茶素-肌原纖維蛋白凝膠二級結構的影響Table 3 Effect of flaxseed gum on secondary structures of catechinsmyo fi brillar protein

3 結 論

兒茶素降低了肌原纖維蛋白的凝膠性能，添加較低含量的亞麻籽膠可以增強蛋白的凝膠強度，而較高含量的亞麻籽膠降低了凝膠強度，但增強了凝膠保水性；兒茶素使凝膠束縛水的能力降低，而加入亞麻籽膠后，可提高凝膠束縛水的能力；亞麻籽膠添加量越高，最終形成凝膠的儲能模量G’越大，凝膠彈性越好；加入亞麻籽膠后，凝膠中的α-螺旋含量增加，而β-折疊、β-轉角和無規卷曲含量均降低。因此，不同含量的亞麻籽膠可改善兒茶素對凝膠特性的不利影響。