花青素與小麥蛋白相互作用及對蛋白質結構的影響

王 晨，謝巖黎*，范亭亭

（河南工業大學糧油食品學院，河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室，河南 鄭州 450001）

面筋蛋白是小麥粉中的主要儲存蛋白，主要由醇溶蛋白（gliadin，Gli）及麥谷蛋白（glutenin，Glu）組成[1]。Gli屬于單體蛋白，有4 種類型，分為α、β、γ、ω四種類型，Gli決定面團的黏性[2]。Glu是多肽鏈通過分子間二硫鍵相互連接成的大分子聚合物，主要由2 種亞基組成，分別為低分子質量亞基和高分子質量亞基，其分子內含有較多的β-折疊結構，易發生聚集作用，主要為面團提供彈性[3-4]。

花青素是植物多酚類化合物的其中一種，它廣泛存在于谷物、水果和蔬菜中，并且可以產生鮮艷的色彩[5]。由于它能夠預防心血管疾病、癌癥并具有抗炎、抗菌及抗氧化的能力，近年來膳食花青素受到越來越多的關注[5-7]。以富含花青素的谷物如黑豆粉為配料，添加到小麥粉中加工成主食品。在食加工中，多酚類會與小麥粉中的蛋白質發生共價或共價交聯，從而影響到面團的流變性及面制品的品質[8-10]。Hager等[11]發現沒食子酸交聯蛋白質可以改善面筋蛋白的彈性；Liu Rui等[9]向小麥粉中添加低聚原花青素可以改善面團的黏彈性及面筋蛋白的穩定性。這些植物多酚可以通過二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用和面筋蛋白發生相互作用[6]。天然植物多酚對人體也有很多益處，包括抗氧化、抗菌和抗動脈硬化作用[9]，它還能降低過敏性。例如，Pérot等[7]發現蔓越莓多酚能夠有效降低小Gli的免疫原性和致敏性。因此，植物多酚作為天然、安全、有效的小麥粉添加劑，能夠有效地提高面制品的營養價值及增筋作用。但是多酚對于面筋蛋白的作用機制并不清楚，了解多酚與面筋蛋白（Gli和Glu）的相互作用方式及本質是必要的。本實驗利用多光譜學研究了花青素與面筋蛋白（Gli和Glu）的相互作用。

本實驗利用熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜研究花青素與Gli、Glu相互作用之間的表觀結合常數、結合位點數、作用力及對兩種蛋白結構的變化，為花青素對主食品品質的影響及花青素作為一種天然食品添加劑在主食品產業發展提供可靠的理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

矢車菊素-3-O-葡糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G），純度98%，由實驗室自制[12]；Gli（純度95%）上海梯希愛化成工業發展有限公司；Glu（純度＞85%）上海源葉生物科技有限公司；實驗中所用試劑均為分析純；所用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

UV-6100S型分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；F-7100FL熒光分光光度計 日本Shimadzu公司；ALPHA傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克分析儀器（上海）公司；LGJ-10C冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司；DL-5-B離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

C3G溶液：用pH 7.0的磷酸緩沖液配制50 mg/L的C3G溶液，實驗時稀釋到所需質量濃度；Gli溶液：稱取一定質量的Gli，用75%乙醇溶液溶解，溶液稀釋至100 mg/L。Glu溶液：稱取一定質量的Glu，用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L）溶解，離心（因為Glu只溶于稀酸或稀堿），取上清液稀釋至需質量濃度，備用。

1.3.2 熒光光譜分析

向一定濃度的Gli及Glu溶液添加不同量的C3G溶液，使最終蛋白質質量濃度為50 mg/L，C3質量濃度分別為0、4.49、8.99、13.48、17.97、22.47、26.96 mg/L，于25、35、45 ℃的恒溫水浴鍋中水浴1 h后測定。熒光光譜測定條件：激發波長280 nm，發射波長300～450 nm，激發波長和發射波長狹縫寬度均為5 nm，同步熒光光譜測定條件如下：25 ℃，分別設定激發波長與發射波長之間的固定波長差Δλ為15 nm及60 nm，進行同步熒光光譜掃描。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

將Gli-C3G、Glu-C3G的混合液（Gli質量濃度為50 mg/L、Glu質量濃度50 mg/L、C3G質量濃度分別為0、13.48、26.96 mg/L）冷凍干燥，按樣品粉末與溴化鉀粉末質量比1∶50混合，置于模具中壓片，分辨率為32 cm-1掃描16 次，在4 000～4 00 cm-1波數范圍內掃描紅外光譜。

利用Peak Fit4.12軟件對圖譜中1 700～1 600 cm-1酰胺I帶區域進行分析，通過校正基線、去卷積、二階導數求導，將不同的譜帶完全分辨開，參照文獻[13]確定各子峰與不同二級結構的對應關系后（表1），根據各子峰面積計算各部分二級結構的相對含量。

表1 蛋白質紅外光譜吸收波數與二級結構的關系[13]Table 1 Relationship between infrared absorption characteristics and protein secondary structure

1.4 數據統計分析

每組數據均做3 次平行，利用Origin 8.5軟件進行數據處理與作圖。利用SPSS 16.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析及相關性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜分析

2.1.1 C3G對Gli、Glu內源性熒光光譜的影響

熒光光譜法是研究小分子與蛋白質相互作用較為普遍的方法。由于熒光基團與猝滅劑分子的相互作用使得量子產率減小，從而產生熒光猝滅現象[14]。一般發熒光的蛋白質分子含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，它們最大熒光強度的波長分別為348、303 nm和282 nm[15]。由于酪氨酸極易被猝滅，苯丙氨酸量子產率過小，研究小分子物質與蛋白質相互作用常用色氨酸的熒光信息。以280 nm為激發波長，蛋白質的全部熒光主要來源于色氨酸，其次還有酪氨酸。而以295 nm為激發波長，蛋白質的熒光全部來源于色氨酸，但是其熒光強度過低[16]。本實驗以280 nm為激發波長研究C3G與Gli、Glu的相互作用。

圖1 C3G對Gli（A）、Glu（B）熒光光譜的影響Fig. 1 Fluorescence emission spectra of C3G-Gli (A) and C3G-Glu (B)systems at pH 7.0 and 25 ℃

由圖1可知，C3G對兩種蛋白的熒光都有猝滅作用，且猝滅效果隨C3G質量濃度的增大而增強。在激發波長280 nm，Gli、Glu的最大發射波長（λmax）分別為342.2 nm（圖1A）和342.6 nm（圖1B），加入C3G后，Gli、Glu的λmax都發生了紅移現象，這說明C3G與兩種蛋白都發生了相互作用，導致Gli、Glu的色氨酸周圍微環境由疏水性環境向親水性環境發生轉變，C3G是水溶性物質，可與蛋白質的親水性側鏈殘基發生相互作用從而使得蛋白質的肽鏈變得更加伸展，從而使得蛋白質的構象發生變化[17-18]。而Gli紅移1.6 nm，Glu紅移1 nm，這說明C3G與Gli作用更強。

2.1.2 熒光猝滅機理的判定

小分子結合蛋白的熒光猝滅機制熒光猝滅分為靜態猝滅與動態猝滅，靜態猝滅由于猝滅劑與熒光基團形成復合物，其猝滅常數隨著溫度的上升呈下降的趨勢。動態猝滅表現為溫度的升高增加離子的擴散和碰撞，其猝滅常數隨著溫度的上升而增大。利用Stern-Volmer方程對猝滅類型進行判斷[2]：

式中：F0、F分別為不添加C3G與添加C3G后黑豆分離蛋白的熒光強度；[Q]為C3G濃度/（mol/L）；KSV為動態猝滅常數/（L/mol）；Kq為生物大分子猝滅速率常數/（L/（mol·s））；τ0為不存在猝滅劑時熒光分子的壽命，平均壽命約為10-8s。

圖2 不同溫度條件下C3G猝滅Gli（A）、Glu（B）的Stern-Volmer圖Fig. 2 Stern-Volmer plot of F0/F as a function of C3G concentration at different temperatures for C3G-Gli (A) and C3G-Glu (B) systems

表2 C3G-Gli、C3G-Glu復合物的熒光猝滅常數及線性相關系數Table 2 Stern-Volmer quenching constants (KSV) and molecular quenching constants (Kq) for C3G-Gli and C3G-Glu systems at different temperatures

根據Stern-Volmer方程（1），以F0/F為縱坐標，對[Q]進行線性擬合，經Origin 8.5繪制得圖2，進而得出C3G 與Gli、Glu相互作用的動態猝滅常數（KSV）和生物大分子猝滅速率常數（Kq）。由表2可知，隨著溫度的升高，Glu的KSV不斷減小，這說明C3G對Glu的熒光猝滅機制屬于靜態猝滅。對于生物大分子，各類猝滅劑由擴散碰撞產生的最大動態猝滅常數為2×1010L/（mol·s）[16-17]，又因為C3G與Glu相互作用的Kq值遠大于2×1010L/（mol·s），進一步表明C3G對Glu的猝滅機理是C3G與蛋白結合形成基態穩定復合物所引起的靜態猝滅。溫度由298 K升到308 K時，C3G與Gli相互作用的猝滅常數呈現增大的趨勢，由308 K升到318 K時，KSV值變化不大，而C3G對Gli的猝滅速率常數Kq遠大于最大猝滅常數，可以得出C3G與Gli的相互作用方式是動態猝滅和靜態猝滅同時發生。Joye等[19]研究發現溫度由35 ℃上升至40 ℃時，白藜蘆醇和Gli相互作用的KSV值也呈現增大的趨勢，之后保持不變，這與本實驗中C3G與Gli相互作用的結果一致。

2.1.3 結合常數和結合位點的計算

根據文獻，測定熒光分子和猝滅劑相互作用的結合常數和結合位點數，采用以下公式計算：

式中：F0和F分別為不添加C3G與添加C3G后黑豆分離蛋白的熒光強度；[Q]為C3G濃度/（mol/L）；KA為結合常數；n為結合位點。

圖3 不同溫度條件下 C3G-Gli（A）和C3G-Glu（B）復合物的雙對數圖Fig. 3 Plot of lg[(F0-F)/F] as a function of log of C3G concentration at different temperatures for C3G-Gli (A) and C3G-Glu (B) systems

根據公式（2），以lg[（F0-F）/F]對lg[Q]作圖（圖3），計算出不同溫度條件下C3G與Gli、Glu相互作用的表觀結合常數（KA）和結合位點數（n）（表3），以上數據表明：溫度升高，C3G與Gli的結合常數KA值升高，說明升高溫度增大了C3G-Gli復合物的穩定性，且兩者的反應是吸熱過程[20]。而Glu有著相反的趨勢，說明C3G與Glu的反應是一個放熱過程。不同溫度條件下，C3G與Gli相互作用的KA和n分別為20.827×104L/mol、1.263（298 K），22.463×104L/mol、1.253（308 K），58.060×104L/mol、1.355（318 K）。相比于Glu，C3G與Gli相互作用的KA和n都較大，說明C3G與Gli的結合能力較強。這兩種蛋白的結合位點數n都接近 1，由此可知C3G與兩種蛋白之間都形成了物質的量比約1∶1的靜態復合物[21]。

表3 C3G-Gli和C3G-Glu復合物的結合位點數、表觀結合常數及線性相關系數Table 3 Apparent binding constants, number of binding sites and linear correlation coef fi cients of C3G-Gli and C3G-Glu systems

2.1.4 熱力學參數與相互作用力類型

根據Van’t Hoff方程用計算熱力學參數[22-23]：

式中：ΔH、ΔG和ΔS分別表示焓變/（kJ/mol）、吉布斯自由能變化/（kJ/mol）、熵變/（J/K）；R為氣體常數8.314 J/（mol·K）；T為實驗溫度；KA為相應的溫度下的結合常數；結合反應的焓變在溫度相差不大時，可視為常數[23]。

小分子和蛋白結合的相互作用力主要有4 種：1）ΔH＞0、ΔS＞0時，疏水相互作用；2）ΔH＞0、ΔS＜0時，靜電和疏水相互作用；3）ΔH＜0、ΔS＜0 時，范德華力和氫鍵相互作用；4）ΔH＜0、ΔS＞0時，靜電相互作用[22]。從表4可以看出，對Gli而言，ΔH＞0、ΔS＞0，說明C3G與Gli之間的作用力主要為疏水作用，ΔH＞0，表明兩者之間的相互作用為吸熱反應，升溫應有利于兩者結合；而對Glu而言，ΔH＜0、ΔS＜0，說明C3G與Glu的主要作用力為范德華力和氫鍵，ΔH＜0，表明C3G和Glu之間的反應是放熱的，降溫應有利于兩者結合。另外，兩種蛋白的ΔG都小于0，說明C3G與這兩種蛋白的結合都是自發的。

表4 C3G與Gli、Glu結合的相關熱力學參數Table 4 Thermodynamic parameters of C3G-Gli and C3G-Glu systems

2.1.5 同步熒光光譜

圖4 C3G-Gli和C3G-Glu體系的同步熒光光譜Fig. 4 Synchronous fluorescence spectra of C3G- Gli and C3G-Glu systems

同步熒光分析被應用于研究蛋白質的構象，特別是熒光基團微環境的變化，具有選擇性高、譜圖簡化、光散射干擾少等特點[24]。通過設定Δλ，獲得熒光光譜。當Δλ為15 nm時，只顯示酪氨酸殘基的特征熒光光譜；當Δλ為60 nm時，只顯示色氨酸殘基的特征熒光光譜[25]。所以，可判斷蛋白質酪氨酸殘基和色氨酸殘基在C3G作用下附近微環境的極性變化。

從圖4可以看出，隨著C3G質量濃度的增大，Gli、Glu的酪氨酸和色氨酸殘基熒光強度均有猝滅現象且最大吸收波長均有不同程度的紅移現象。這說明C3G與兩種蛋白都發生了相互作用，并使得蛋白質構象發生一定的改變，進而使得兩種蛋白中色氨酸和酪氨酸附近的微環境向親水性環境轉變，疏水性減小[26-27]。Gli中酪氨酸殘基（圖4A1）和色氨酸殘基（圖4A2）分別紅移0.2 nm和0.4 nm；而Glu酪氨酸殘基（圖4B1）和色氨酸殘基（圖4B2）分別紅移1.2 nm和0.8 nm，這說明C3G與Gli的結合位點更接近色氨酸殘基，而與Glu的結合位點更接近酪氨酸殘基[28]。

2.2 傅里葉變換紅外光譜

圖5 C3G與Gli、Glu復合的Peakfit擬合圖譜Fig. 5 Secondary derivative resolution enhancement and curve fi tted amide I band

蛋白質酰胺I帶吸收峰的變化反映了蛋白二級結構的變化（1 700～1 600 cm-1）[13]，由圖5可知，加入不同濃度的C3G后，兩種蛋白的紅外擬合峰數目及峰形發生明顯變化，蛋白的二級結構所占百分比也發生改變，表明加入C3G后，兩種蛋白的構象都發生了改變。由表5可知，兩種蛋白質的二級結構中，β-折疊結構所占比例最高。隨著C3G的加入，Gli中β-折疊和β-轉角結構有減少的趨勢，而α-螺旋和無規卷曲含量有增大趨勢，這與Tozzi等[29]的研究結果一致，可能是由于C3G和Gli作用后形成了復合物，導致肽鏈上羰基氫鍵的重排，從而引起Gli結構的變化。Glu中β-折疊含量減少，α-螺旋和β-轉角含量增加，而無規卷曲含量無明顯變化（P＞0.05），這與史春悅[30]的研究結果一致，可能是由于C3G與Glu之間形成的鍵是由疏水相互作用引起的。相比于C3G對Glu二級結構的影響，可以檢測到C3G存在時Gli更多的變化，可能是由于C3G與Gli的相互作用更強[31]。這與內源性熒光的結果一致。

表5 C3G對Gli、Glu蛋白質二級結構相對含量的影響（x± s，n=3）Table 5 Effect of C3G concentration on secondary structure of Gli and Glu (x± s, n= 3)%

3 結 論

本實驗采用熒光光譜、同步熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜3 種方法研究C3G與Gli、Glu的相互作用及對蛋白質結構的影響，主要結論如下：1）熒光圖譜結果表明C3G對Gli、Glu都有熒光猝滅作用，與Glu的猝滅機制屬于靜態猝滅，主要通過疏水相互作用相結合；與Gli的猝滅機制為靜態猝滅和動態猝滅的結合，主要通過范德華力和氫鍵作用結合。2）Gli、Glu與C3G結合位點數n都接近1，形成了物質的量比約1∶1的靜態復合物；同步熒光光譜表明C3G與Gli的結合位點更接近色氨酸殘基，而與Glu的結合位點更接近酪氨酸殘基。3）傅里葉變換紅外光譜數據表明C3G的加入改變了小麥蛋白結構，Gli表現為β-折疊和β-轉角占總空間結構百分比減少，而α-螺旋和無規卷曲結構相對含量增加；Glu表現為β-折疊相對含量減少，α-螺旋和β-轉角相對含量增加，無規卷曲相對含量變化不大。