脂質體水凝膠結構變化與形成機理

劉瑋琳，孔有余，許賢康，鄭凌藝，柳葉霏，韓劍眾*

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

脂質體是由雙親性分子自組裝形成的運載體系，具有高穩定性[1]、靶向性[2]、生物相容性[3]和緩釋性[4]等優點，已在食品、生物、醫學、農學等領域有廣泛應用[5-7]。近年來，脂質體逐漸在食品領域嶄露頭角，用以保護敏感性功能成分的穩定性或提高生物利用率[8-10]。水凝膠是介于固體與液體間的一種半固體結構體系，具有高分子網絡狀結構[11-12]。其中，互穿聚合物網絡結構（interpenetrating polymer network，IPN）[13]作為水凝膠的一種，存在化學交聯點使其在大部分溶劑中只能溶脹而不溶解，不發生蠕變和流動，從而有更好的黏接力[14-15]。水凝膠既可以作為一種食品，又可利用其緩釋性作為一種營養強化劑[16]。

脂質體水凝膠是一種通過物理或化學交聯的方式將脂質體與凝膠結合，從而提高脂質體包封能力和緩釋作用的新型運載體系。Ditiaio等[17]在20世紀90年代開始了脂質體水凝膠的研究，在醫用硅膠中植入抗生素的脂質體水凝膠減少術后恢復的細菌感染率，與Gao Weiwei等[18]將包埋抗菌藥物的脂質體水凝膠能抵抗金黃色葡萄球菌感染相驗證。但是，當前脂質體水凝膠的應用主要集中在藥學和材料學領域，而在食品中僅見如包埋白藜蘆醇以提高其釋放效率的報道[19]，脂質體水凝膠運輸其他活性成分及在消化道的降解研究鮮見。

綜上所述，本實驗采用涂層法制備脂質體與IPN膠交聯構建脂質體水凝膠并表征其物化性質（粒徑、質構、微觀形貌）；以膨脹系數、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、差熱分析和交聯率探求兩者間的交聯機理和脂質體在水凝膠的包埋方式，為脂質體水凝膠應用到食品領域提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵磷脂、殼聚糖 美國Sigma公司；明膠、Hepes、氯化鈉 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；轉谷氨酰胺酶（microbial transglutaminase，mTG） 泰興市一鳴生物制品有限公司；磷測試盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

D11971型超純水系統、Multiskan Spectrum全波長酶標儀 美國Thermo Scientific公司；Sorvall BiofugePrimo R型高速冷凍離心機 美國Kendro公司；TA.XT Plus型組織分析儀 德國IKA公司；SW22型振蕩水浴槽 德國Julabo公司；pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MS3000型激光粒度分析儀 英國Malvern公司；Nicolet FTIR成像系統美國熱電公司；DTA-800差熱分析儀 上海研錦科學技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂質體的制備

采用涂層法[20]，將高質量濃度的磷脂溶液均勻涂在聚四氟乙烯板上，并放置在培養皿中，在55 ℃條件下用Hepes（0.05 mol/L、pH 5.5）溶液進行浸沒洗膜，避光密封處理，獲得磷脂質量濃度為50 mg/mL的脂質體。

1.3.2 脂質體物化性質的測定

采用動態激光粒度儀測量脂質體的平均粒徑和表面電位。取1 mL脂質體用純水稀釋至10 mL，混勻后取樣放入樣品池中進行測定，測定條件為20 ℃，磷脂和分散介質的折射率的比值為1.120。每個樣品至少平行測定3 次。

通過透射電子顯微鏡表征脂質體微觀形貌。用蒸餾水將脂質體稀釋至1 mg/mL，將樣品滴加到銅網，而后用醋酸雙氧鈾溶液（2%）染色4 min，用濾紙吸去多余的液體后，在室溫條件下晾干，用透射電子顯微鏡表征其微觀結構。

1.3.3 脂質體水凝膠的制備和物化性質分析

1.3.3.1 水凝膠的制備

明膠在55 ℃條件下用超純水溶解（6 g/100 mL），殼聚糖用1%的冰乙酸溶液溶解（3 g/100 mL）。分別將明膠與殼聚糖的質量比按1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1進行混合，與55 ℃恒溫振蕩混勻，30 min后分別加入質量濃度為0、0.1、5、10、50 mg/mL的mTG，繼續55 ℃恒溫振蕩60 min，取出冰浴快速冷卻至出現固體的凝膠，于KCl（0.01 mol/L、pH 5.5）溶液浸沒2 h，取出4 ℃靜置過夜。

1.3.3.2 脂質體水凝膠的制備

水凝膠的制備按1.3.3.1節方法進行，其中在mTG之后再迅速加入脂質體溶液，使脂質體在凝膠中的最終質量濃度為12.5 mg/mL。

1.3.3.3 脂質體水凝膠的外觀形貌

對不同配方脂質體水凝膠進行外觀拍照。

1.3.3.4 脂質體水凝膠的質構分析

將不同配方的脂質體水凝膠低溫（4 ℃）保存過夜后進行硬度、黏性及回復力等質構特性測定，選擇質地剖面分析（texture profile analysis，TPA）模式，具體參數為：探頭P/25，壓縮比30%，測前、測中和測后速率均1 mm/s，測定停留時間5 s，觸發力5 g，每組樣品做多次平行實驗[21-22]。脂質體水凝膠的TPA2采用硬度、彈性和咀嚼性表征，其中，硬度指的是第1次壓縮樣品時的最大壓力峰值，感官上代表了用牙齒咬斷樣品時所需的力；彈性指兩次穿刺樣品高度的比值，反映了除去外力后樣品形變的恢復量；回復力指兩次穿刺后抵抗外界破壞所需的能力。

1.3.4 脂質體水凝膠結構的形成機理

1.3.4.1 脂質體水凝膠的膨脹系數

采用Cui Li等[13]的方法。將脂質體水凝膠平均切成15 mm×15 mm×10 mm長寬高的比例，切好的小塊凝膠靜置在Hepes溶液中（0.05 mol/L、pH 5.5、37 ℃），在不同時間間隔取出凝膠樣品，用干燥濾紙吸干外表面的水珠，稱質量。膨脹系數計算如式（1）所示：

式中：Wt為在t時間點的吸水膨脹的樣品質量；Wo為初始樣品的質量。

1.3.4.2 脂質體水凝膠FTIR分析

稱取經過凍干處理后的脂質體、空白水凝膠（不加脂質體）和脂質體水凝膠樣品，與干燥處理過的KBr粉末按照1∶100的比例在研缽中充分研磨壓片，以空氣為背景采集FTIR譜圖，設置掃描次數為64 次，在4 000～400 cm-1波數范圍內全波段掃描分析。

1.3.4.3 脂質體水凝膠的差熱分析

每個鋁盤里封裝2～6 mg的經過凍干處理后的脂質體、空白水凝膠和脂質體水凝膠樣品，使用DTA-800差熱分析儀進行分析，裝有脂質體的鋁盤作為空白對照組。所有的鋁盤都需要放在密室中，在30 ℃保持5 min，以10 ℃/min的速率從30～400 ℃快速升溫，氮吹的速率為20 mL/min。

1.3.4.4 脂質體水凝膠的交聯率

采用Cui Li等[13]的方法進行測量。所需溶液配制如下：溶液I：將1.05 g的檸檬酸溶解在10 mL（0.1 mol/L）的NaOH溶液中，再混合0.04 g的SnCl2·H2O，用去離子水稀釋到25 mL；溶液II：1 g的尼京平溶解在25 mL乙二醇溶液；標溶液III：將溶液I與溶液II進行混合，磁力攪拌45 min并存于暗室。凝膠前處理需冷凍干燥24 h。測量前，1.5 mg的凍干樣品混合2 mL的溶液III在100 ℃水浴加熱20 min，快速冷卻至室溫，用15 mL的50%異丙醇溶液稀釋，分光光度計在570 nm波長處記錄其吸光度。凝膠交聯率的計算如式（2）所示：

式中：Mo為未交聯樣品中自由氨基酸的摩爾分數；Mt為交聯樣品中自由氨基酸的摩爾分數。

1.4 統計分析

每項指標均至少重復測量3 個平行樣品，并設置相應的對照組。采用Microsoft Office Excel 2007和Origin 8.5軟件進行數據整理和分析。

2 結果與分析

2.1 脂質體的物化性質

圖1 脂質體在電子顯微鏡下的微觀“囊泡狀”結構Fig. 1 Transmission electron micrographs of liposomes

由圖1可知，脂質體形狀規整，呈囊泡狀結構，分布較均勻，顆粒間彼此分散、獨立。通過動態激光粒徑電位儀測得脂質體平均粒徑為（1 353±141.0）nm，表面電位為（-0.72±0.49）mV。由于本實驗采用涂板薄膜分散制備脂質體，屬于自發膨脹的自組裝而成，未進行二次高壓力或者高剪切處理，其形狀結構完整、粒徑較大；且該脂質體帶電荷少，電位偏中性。粒度儀測量所得粒徑值與透射電子顯微鏡觀察結果基本相符。

2.2 脂質體水凝膠物化性質

2.2.1 脂質體水凝膠的外觀形貌

圖2 脂質體水凝膠的形態圖Fig. 2 Visual appearance of lips-in-gels

判斷凝膠的形成采取最直觀的倒置分析法，如圖2所示。對于能穩定成膠的樣品，其物理結構會形成穩定的固體或半固體形態，能夠保持基本的“站立”狀態，所以在進行倒置時，膠體不容易坍塌或流動。圖2A中，明膠與殼聚糖比例為4∶1和2∶1形成的膠，倒置狀態下均保持非常穩定的固體狀態，Cui Li等[13]認為二者可能是通過共價鍵結合在一起。在1∶1和1∶2的比例中，其膠的結構發生了坍塌，有一定的流動性，而1∶4比例則明顯不具備膠的半固體狀態，基本不能成膠，圖2B、C分別為不同質量濃度的mTG制備的水凝膠（明膠與殼聚糖的比例為4∶1）和加入了脂質體的水凝膠與空白水凝膠的對比，其中mTG是一種良好的交聯劑。圖2B中5 種水凝膠均可以保持穩定的“站立”狀態，均呈現膠的基本結構，圖2C水凝膠中添加了脂質體之后同樣也很好地保持了膠的固體形狀。

2.2.2 脂質體水凝膠的質構分析

圖3 水凝膠的硬度、黏性和回復力質構指標Fig. 3 Hardness, adhesiveness and resilience of hydrogels

由圖3A得出，隨著明膠比例增高，水凝膠的硬度也逐漸增大；在殼聚糖比例大于明膠時，無法成膠，故不計算其質構系數。當明膠與殼聚糖比例為4∶1時，脂質體水凝膠的耐咀嚼性為最優。回復力在整個體系中呈現拋物線形態，在明膠與殼聚糖比為2∶1時出現峰值。綜合各質構結果，采取明膠與殼聚糖比4∶1為后期實驗的制膠比例。從圖3B可以看出，當mTG質量濃度為10 mg/mL時，其成膠穩定性最好，硬度重復性最強，硬度達到了18.68 g；當mTG質量濃度高于10 mg/mL時，4 ℃過夜貯存出現大量脫水的現象，因此本研究選擇mTG質量濃度為10 mg/mL。圖3C為脂質體水凝膠與空白水凝膠的質構對比，脂質體水凝膠的硬度和黏彈性相較未添加脂質體的水凝膠有很大的提升，可能是因為凝膠內部充斥著大粒徑的脂質體囊泡，使其膠的空間結構得到支撐，從而提高了膠的硬度[23]。

2.3 凝膠結構的形成機理

2.3.1 脂質體水凝膠的膨脹系數

圖4 空白水凝膠和脂質體水凝膠在KCl溶液（pH 5.5、0.01 mol/L）中的膨脹系數Fig. 4 Swelling behaviors of hydrogels and lips-in-gels in KCl solution(pH 5.5, 0.01 mol/L)

由圖4可知，脂質體水凝膠和空白水凝膠的膨脹系數都是呈上升趨勢，與之前文獻報道水凝膠浸沒于相同pH值條件下的離子溶液中都是出現了吸脹的屬性相符[24]。在0～3 h之間，兩者都是極快吸水膨脹，3 h后兩者都出現輕微的脫水；但在7～24 h之間，空白水凝膠和脂質體水凝膠又呈現穩定的膨脹過程，但是此吸水能力相較之前的快速吸水發漲能力略有下降，說明兩種膠之間的網狀空洞結構基本都被水分子填滿，特別是脂質體水凝膠在18 h之后，質量基本保持平穩不變。但是，空白水凝膠的膨脹能力比脂質體水凝膠更強，可能是在這段時間里空白水凝膠仍具備一定能力的吸水膨脹，而脂質體水凝膠中的網狀結構已經被脂質體的囊泡結構所填滿，其空間結構已經基本接近飽和，無法攜帶更多的水分子。

2.3.2 脂質體水凝膠FTIR分析

圖5 脂質體、空白水凝膠和脂質體水凝膠的FTIR圖Fig. 5 FTIR spectra of liposomes, hydrogels and lips-in-gels

由圖5可知，殼聚糖與明膠構成的空白水凝膠的FTIR圖譜在3 276 cm-1處形成了明顯的—O—H伸縮振動吸收寬鋒，在1 682 cm-1處出現了殼聚糖酰胺N—H伸縮振動吸收峰，這兩個特征峰都同時在脂質體水凝膠中出現相同的峰位置，說明相應的功能基團都在脂質體水凝膠中出現。脂質體水凝膠中在2 849 cm-1出現了較大吸收峰，但空白水凝膠在此未明顯觀察到吸收峰，主要因為脂質體壁材中的磷脂CH2基團的對稱和非對稱吸收峰的介入。磷脂結構中的C—C—N＋、C＝O、P＝O和P—O—C的伸縮振動吸收峰分別是960、1 740、1 220、1 090 cm-1，相比于脂質體，脂質體水凝膠中C＝O吸收峰缺失，可能是由于水凝膠中mTG的氨與其交聯形成胺基所致[25-26]。在這之后脂質體的相關特征吸收峰在水凝膠上形成峰位移，可能是由于明膠和殼聚糖中的雜環與磷酯通過氧激進誘導聚合和脫氫形成了雜環交聯化合物[27]。在整個由溶液狀的脂質體與水凝膠混合冷卻形成的固態脂質體水凝膠過程中，是形成了一系列復雜的化學交聯反應，脂質體還可能通過氫鍵的關系與之聯結[27]。

2.3.3 脂質體水凝膠的差熱分析

圖6 脂質體、空白水凝膠和脂質體水凝膠的差熱分析Fig. 6 DSC spectra of liposomes, hydrogels and lips-in-gels

從圖6可知，脂質體、空白水凝膠和脂質體水凝膠在高溫下均為吸熱反應，且最大的吸熱峰均在不同位置，分別對應的是133.126、117.726 ℃和126.891 ℃。脂質體本身由磷脂組成，水凝膠的形成為蛋白和多糖通過mTG交聯，若為物理交聯的膠，其本身沒有重新產生化學鍵而是通過靜電吸附形成；而脂質體水凝膠應出現兩個吸熱峰，各自對應磷脂和蛋白多糖交聯的部分；但從圖6可以看到，脂質體水凝膠只出現1 個大吸熱峰，說明兩者已經產生了一定程度的化學交聯，推測可能是mTG中的氨與C＝O形成了胺基，雜環與磷酯鍵通過復雜的交叉反應誘導聚合，以及出現了氫鍵的原因[28]。脂質體水凝膠在250 ℃后出現了2 個小峰，而脂質體差熱曲線也均含有這2 個峰，但空白水凝膠卻沒有此現象，這也從另一個角度證實了水凝膠確實包埋了脂質體。

2.3.4 脂質體水凝膠的交聯率

圖7 空白水凝膠和脂質體水凝膠的交聯率Fig. 7 Cross-linking degrees of hydrogels and lips-in-gels

交聯率根據其中存在的自由氨基酸的比值進行計算[13]。空白水凝膠和脂質體水凝膠有蛋白和多糖的結構，而脂質體由磷脂組成。由圖7可以分析，空白水凝膠和脂質體水凝膠均檢測出自由氨基酸含量，且脂質體水凝膠的交聯率比空白水凝膠低。本研究使用的水凝膠由殼聚糖和明膠通過mTG交聯形成，一部分的羰基和氨基形成胺基，雜環上的不穩定二價鍵通過共價破壞與磷酯形成交叉反應，所以整個水凝膠的自由氨基酸比例有所降低，交聯率也隨之降低，該結果與前面實驗所得對應。

3 結 論

本實驗通過研究不同條件形成的水凝膠的物化性質及包埋了脂質體的水凝膠性質，選擇最優配方的同時，闡析了脂質體與水凝膠的相互交聯機制。實驗最終選取明膠與殼聚糖比4∶1、mTG質量濃度10 mg/mL為最優條件，此配方下質構表現最優。相較空白水凝膠，脂質體水凝膠的膨脹系數更小，是由于脂質體水凝膠中的網狀結構已經被脂質體的囊泡結構所填滿，其空間結構已經基本接近飽和；同時，FTIR和差熱分析顯示脂質體中的C＝O、P＝O鍵與空白水凝膠中的氨和雜環形成胺基和其他復雜結構，而交聯率也同時證明了脂質體與水凝膠之間的交聯是通過化學交聯的方式，破壞了一系列的官能團產生了復雜的共價鍵和氫鍵。本研究為脂質體水凝膠應用于食品消化和營養因子的緩釋作用提供了理論參考，也可為開發脂質體水凝膠的營養食品提供技術參考。