化學改性對核桃谷蛋白結構表征及功能特性的影響

孫 乾，張愛琴，薛雨菲，曹文利，奚鳳玲，王榮浩，李 芳，孔令明,*

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業技術學院，新疆 烏魯木齊 830021）

核桃（Juglans regia）在我國多省都有種植。到2016年，我國核桃種植面積超500萬 hm2，年產量近300萬 t，其占經濟類樹林總面積的15%左右，居世界之首[1]。核桃營養豐富，含蛋白15%～20%、含脂肪60%～70%、含人體所必須的多種VA、VE、VD、VK等較高[2]。核桃中的優質植物蛋白，是促進大腦活性和減緩衰老的健康蛋白[3-4]。目前，核桃的食用性，一般為榨油或直接食用。但對核桃榨油后副產物的綜合性利用，以及占核桃蛋白總量70%以上的谷蛋白的研究還鮮有報道，對產業化生產脫脂、分離、濃縮核桃粉，都缺乏規模化、科研化、技術化、集約化的深加工。由相關的文獻論述[5]，核桃蛋白大部分為谷蛋白，其不溶于水、油，因此，極大限制了核桃蛋白在食品領域中的應用。

蛋白質的化學性修飾主要是氨基酸的殘基化修飾，其中分為酰基化、磷酸化、糖基化等反應，這些反應都是針對氨基酸殘基上的—COOH、—OH、—NH2和—SH加以改性作用[6]。通過改性可改善原蛋白的一些功能特性，諸如溶解度、持水（持油）性、乳化特性、熱穩定性、表面特性、凝膠性等。常使用的酰化劑有琥珀酸酐、馬來酸酐等；常用的磷酸鹽有復合磷酸鹽、三聚磷酸鈉、多聚磷酸鈉等。

有研究者采用不同改性劑對蛋白進行改性，高度的酰基化使蛋白在偏堿性的環境下溶解度增加，POCl3改善了蛋白結構，提高了蛋白質功能特性[7]。磷酸化的改性，使蛋白空間結構得以改變，肽鏈的延展伸縮，溶解度有所提高，隨著溶解度的提高，其乳化性等功能特性以及黏度都有相應的提高；劉雯等[8]以提取率為參照指標，發現大豆蛋白改性前后有4.37%和23.46%的提高；奚海燕[9]以磷酸化程度為指標，發現3%的三聚磷酸鈉使大豆蛋白有最大改性。

熒光光譜是研究液態蛋白質分子構象的一種方法，其可以通過對氨基酸的熒光特性反映蛋白的疏水性，且靈敏度高、方法簡單、所需樣品量少；紫外分光光度法可研究蛋白二級和三級結構變化，以及測定蛋白的溶解度、乳化性等，其靈敏度高、選擇性好、精密度高；傅里葉紅外光譜可以對蛋白質二級結構在不同環境下定性和定量分析，其分辨率高、重復性好、測量簡單、掃描較快；圓二色光譜又稱圓二色曲線，遠紫外區一般是肽鍵的吸收峰，反映蛋白質主鏈的構象，近紫外區一般是蛋白質的側鏈基團，反映氨基酸及其殘基的細微構象變化。

核桃供應量持續增長，開發率依然較低，初加工耗時費力，附加值始終不高。因此，為更加有利于核桃資源的開發，實驗采用化學方法對核桃蛋白進行改性處理，以此使核桃餅粕中的優質蛋白得以更加全面的綜合性利用，對核桃產業的精深加工意義深遠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃餅粕（榨油后制得） 新疆中亞食品有限公司；核桃谷蛋白（walnut glutenin，WG）由核桃餅粕制得；大豆油 新疆友好集團股份有限公司。

十二烷基硫酸鈉、氯化亞錫（SnCl2·H2O） 北京索來寶科技有限公司；琥珀酸酐（丁二酸酐） 上海源葉生物科技有限公司；三聚磷酸鈉、無水乙醚、石油醚（均為分析純） 天津致遠化學試劑有限公司；溴化鉀（色譜純） 山東嘉穎化工科技有限公司；2-乙氧基乙醇（分析純） 北京津同樂泰化工產品有限公司。

1.2 儀器與設備

Testo205便攜式數顯pH計 德圖儀表（深圳）有限公司；PL203電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器有限公司；TDL-5-A低速離心機 上海安亭科學儀器廠；ALPHA 1-2型真空冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；TU-1810PC紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；SENS-9003型熒光光譜分析儀 北京卓立漢光儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；J-810圓二色光譜儀 日本Jasco公司；JEOL700F掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 WG的制備

工藝流程：核桃餅粕→脫脂核桃粕→加去離子水→離心→沉淀→加NaCl→離心→沉淀→加體積分數70%的乙醇→離心→沉淀→加NaOH溶液調pH值→離心→上清液→加HCl溶液調pH值至等電點→離心→沉淀→水洗至中性→真空冷凍干燥→WG[10]。

1.3.2 改性蛋白的制備

工藝流程：WG→制備溶液→攪拌→調pH值→加酰化劑（加磷酸鹽）→攪拌→調pH值→透析→真空冷凍干燥→改性蛋白。

將2.00 g WG分散在30 mL去離子水中，室溫下攪拌1 h，用1 mol/L NaOH溶液調不同pH值，然后分批加入一定量的琥珀酸酐（磷酸鹽），反應過程中不斷攪拌，并用1 mol/L HCl或NaOH溶液維持溶液pH 7.0不再變化至終止反應（一般為5～60 min）。將酰化蛋白溶液在4 ℃透析48～72 h以滲透壓形式過濾未反應的琥珀酸酐，濃縮溶液后進行真空冷凍干燥處理，即為酰化蛋白（acylated protein，AP）。磷酸化蛋白（phosphorylated protein，PP）實驗組不用透析，對照組不添加任何試劑[11]。

1.3.3 溶解度的測定

根據Horax法稍作改動[12]。分別稱取0.10 g WG、AP與PP樣品分散于10 mL去離子水中，室溫下磁力攪拌0.5 h左右，溶液以4 500 r/min離心15 min，留取上清液待用；取空試管，加入5 mL考馬斯G-250，加入50 μL去離子水，再加入50 μL上清液，劇烈振蕩1 min左右以混勻；放置10 min，在波長595 nm處測量，對照組加入5 mL考馬斯G-250，再加入100 μL去離子水。蛋白質溶解度計算如式（1）所示：

1.3.4 熒光光譜分析

精確稱取WG和改性蛋白樣品溶解于pH 7.0的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液中，調蛋白質量濃度為0.3 mg/mL。在25 ℃條件下放置3 h，采用熒光光譜分析儀測定WG、AP與PP的樣品熒光特性。取約5 mL樣液置于四通石英比色皿中，選擇熒光光譜的激發波長為310 nm，發射光譜的波長掃描范圍為410～460 nm，選擇狹縫為5 nm，每個樣液重復掃描3 次。

1.3.5 紫外光譜分析

精確稱取WG、AP與PP樣品溶解于pH 7.0的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液中，調蛋白質量濃度為0.1 mg/mL。取約5 mL樣液置于置于1 cm的石英比色皿，用分光光度計測定樣品的吸光度，樣品的掃描波長范圍為200～400 nm[13]。

1.3.6 紅外光譜分析

精確稱取WG、AP與PP樣品1 mg加入溴化鉀進行緩慢研磨至均一的粉末狀，在模具中以8 MPa壓制2～3 min制成薄片。采用傅里葉變換紅外光譜儀在（4 000～400 cm-1）全波段上掃描，分辨率4 cm-1，波數精度0.01 cm-1，掃描次數32[14]。

1.3.7 蛋白質二級結構的圓二色光譜分析

精確稱取WG、AP與PP樣品溶解于pH 7.0的磷酸緩沖液中，調蛋白質量濃度為0.3 mg/mL。在25 ℃條件下放置3 h，采用圓二色光譜儀測定WG的圓二色性。取約5 mL樣液置于2 mm石英比色皿中，選擇掃描的波長為190～250 nm，掃描速率為100 nm/min，響應溫度為25 ℃，靈敏度為100 mdeg/cm，分辨率為0.5 nm。所測出的圖譜需扣除緩沖液的空白差，每個樣液重復掃描8 次取平均值，蛋白的二級結構采用JASCO結構軟件進行分析，圓二色性以殘基摩爾橢圓率表示（℃·cm2/dmol）。

1.3.8 掃描電子顯微鏡觀察

取WG、AP與PP的粉末樣品進行噴金處理，將樣品處理好之后加壓至20 kV，用掃描電子顯微鏡觀察[15]。

1.3.9 酰化度的測定

采用茚三酮法進行測定，配制質量分數1%的WG、AP與PP樣液，取空試管，加入1 mL樣液，再加入0.02 g/mL茚三酮溶液1 mL，蓋塞搖勻；混合液于100 ℃水浴上加熱10～15 min，取出后在20～25 ℃的水浴中冷卻，加入5 mL去離子水，盡快在波長570 nm波長處測量。對照組以0.02 g/mL茚三酮溶液作空白。酰化度計算如式（2）所示：

1.3.10 持水性的測定

參考Paredeslopez等[16]的研究并作一定修改。準確稱取0.10 g的WG、AP與PP粉末置于離心管中，加入10 mL去離子水，使用離心機4 500 r/min離心15 min。稱取樣品和離心管質量，持水性計算如式（3）所示：

式中：M0為樣品質量/g；M1為離心管與樣品總質量/g；M2為離心管與沉淀物質量/g。

1.3.11 持油性的測定

依照Pedroche等[17]的研究并作一定的調整，準確稱取0.10 g的WG、AP與PP樣品置于離心管中，加入大豆油5 mL，旋渦式振動60 s，然后3 300 r/min離心15 min，吸紙吸去殘留油脂，持油性計算如式（4）所示：

式中：M0為樣品質量/g；M1為離心管與樣品總質量/g；M2為吸油后離心管與樣品總質量/g。

1.3.12 乳化性及乳化穩定性的測定

取空試管，加入5 mL蛋白樣液，加入25 mL去離子水，再加入20 mL大豆油，旋渦式振動60 s，然后2 500 r/min離心乳化5 min，分辨乳化層[18]。乳化性計算如式（5）所示：

精確稱取5 g樣品溶于100 mL去離子水中，調節至pH 7.0，加入50 mL大豆油，高速乳化均質1 min左右；放置于45 ℃水浴中45 min左右，測量乳化層的高度（H0），30 min后再次測量乳化層的高度（H1）[19]。乳化穩定性計算如式（6）所示：

1.3.13 起泡性及泡沫穩定性

精確稱取WG、AP與PP樣品溶解于pH 7.0的磷酸緩沖液中，取空試管，加入10.0 mL樣液（V0），高速乳化均質2 min左右；迅速測量總體積（V1），30 min再次測量總體積（V2）[20]。起泡性與泡沫穩定性計算如式（7）和式（8）所示：

1.4 數據處理

每個實驗做3 次重復。運用Excel 2003進行圖形繪制，光譜圖采用系統自帶軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 酰化度的測定結果

酰化蛋白樣品實驗根據式（2）中對酰化程度加以計算得知，經琥珀酸酐（丁二酸酐）改性的AP其酰化度為（77.26±0.49）%。吸光度的百分數表示游離氨基與茚三酮溶液的反應程度，吸光度越高，反應程度越高，酰化度越低。因此經琥珀酸酐改性后的WG其被酰化的程度較高，說明酰化較充分。

2.2 熒光光譜分析

使用熒光分光光度計對WG、AP和PP進行掃描測定。在310 nm的激發波長處所產生的熒光光譜主要是由于谷蛋白中存在一定量的色氨酸所造成的，譜圖上顯示的熒光峰實質為色氨酸基團由于光激發產生的電子躍遷所導致，峰的位置在428～431 nm波長范圍內（圖1），AP與PP的化學改性可能是由于改變了蛋白質中的氫鍵，使得部分氫鍵產生斷裂，而蛋白分子內部的氫鍵是決定蛋白質分子中α-螺旋和β-折疊穩定性的重要因素，氫鍵的破裂會導致蛋白二級結構的不穩定。熒光強度的改變也說明了色氨酸在改性后出現大量的衰減，且改性蛋白的最大吸收峰強度也發生了輕微的紅移。蛋白分子逐漸展開分子鏈，將更多的親水性基團暴露出來，使得親水性極大增強，從而使溶解度有極大的提高[21-22]。

圖1 WG與改性蛋白的熒光光譜Fig. 1 Fluorescence spectra of natural and modified glutenin

2.3 紫外光譜分析

蛋白的紫外吸收最為關鍵在于蛋白質側鏈上的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基所引起，此3 種氨基酸在蛋白中的存在以及存在的數量性直接決定了蛋白的紫外吸收強度水平。在另一種意義上也與組氨酸和半胱氨酸基團有關，但相關性要弱于前3 個氨基酸。由圖2可知，WG的最大紫外吸收波長為280 nm，這反映了WG的紫外吸收主要是由于其蛋白內的色氨酸和酪氨酸殘基引起的[23]。由圖2所示，當進行酰基化和磷酸化處理時，AP與PP的紫外吸收明顯增強，且這種增強極顯著（P＜0.05）；WG的最高紫外吸收峰出現在280 nm波長處的0.44，而AP與PP的最高紫外吸收峰分別出現在282 nm與283 nm波長處，且吸光度分別為1.69和1.44。經AP與PP處理的蛋白，其兩者之間的差異并不顯著（P＞0.05）。

隨著化學改性的處理，所有改性蛋白的吸收峰均出現在275～279 nm之間，蛋白紫外吸收峰出現藍移，說明色氨酸、酪氨酸等殘基基團所處微環境的極性狀態發生了改變，這種改變也相應會引起肽鍵的斷裂，而肽鏈上的色氨酸、酪氨酸殘基屬于極性氨基酸，所帶的雜環π→π*電子躍遷是引發紫外吸收的關鍵因素，蛋白質肽鏈的逐漸展開，π→π*和n→π*電子的躍遷能量逐漸增大，也導致了紫外吸收的相對增強[24]。

圖2 WG與改性蛋白的紫外光譜Fig. 2 UV absorption spectra of natural and modified glutenin

2.4 紅外光譜分析

蛋白質中的二級結構通常包括α-螺旋、β-轉角、β-折疊和無規卷曲。在酰胺I帶上是蛋白不同二級結構信息的疊加，對譜圖可以進行線性擬合以確定出結構與峰形之間的相對應關系。在1 700～1 600 cm-1的酰胺I帶一般是蛋白質所在的特征峰，也常用于蛋白質二級結構的分析，這主要是由于蛋白質中含有C—O鍵伸縮振動所形成的，也正是因為這樣，此處的信號較強[25-27]。蛋白質作為兩親性結構的代表，疏水性和親水性是決定其乳化性的一個重要指標。

WG主要由其中的谷蛋白組成，這也使得WG持水能力較差，而相比持油性較為穩定，因受到化學改性的作用，改性蛋白在空間結構上受到較大破壞，大量的親水性基團暴露，這也使得WG的親水性有很大的提高。

由圖3可以看出，經過化學改性處理的蛋白，其波形均向高波數藍移了約0.5～1 cm-1。這說明蛋白在受到化學劑的影響下，其結構變得不穩定，原本的結構開始逐漸解離。當氫鍵作用較弱化時，C＝O的電子云密度逐漸升高，導致吸收峰位向高波數方向藍移。由圖3還可以發現，在改性后的蛋白中，α-螺旋結構的含量有一定的升高；相應的無規卷曲與β-轉角結構，基本沒有變化；β-折疊結構含量有一定的上升，這些都表明了核桃蛋白在受到化學改性后，其疏水性的基團逐漸減少，而親水性的基團逐漸增多[28]。α-螺旋和β-折疊是有序的蛋白結構，具有一定的穩定性；而β-轉角和無規卷曲則是無序的蛋白結構，其會較易發生改變。由于化學作用，會產生一定數量的—OH和—COOH，這在一定程度上使得β-折疊結構被破壞，并與α-螺旋和β-轉角之間相互轉化[29]。

圖3 WG與改性蛋白的紅外光譜Fig. 3 Infrared spectra of natural and modified glutenin

2.5 圓二色光譜分析

圓二色光譜常被用作定量分析植物性蛋白二級結構的組成，且可分為遠紫外和近紫外兩個區域，遠紫外區是肽鍵所在的吸收范圍，其能夠較為直觀地反映肽鏈結構。在遠紫外光區，210 nm波長處的負峰顯示具有α-螺旋結構，而α-螺旋結構過于穩定，在一定程度上會阻止蛋白的構象受到改變，蛋白質趨于穩定狀態，不利于蛋白功能特性的改變[30]；相比α-螺旋結構，β-折疊與無規卷曲結構使得蛋白穩定性較差，從而促使蛋白的柔性以及功能特性有良好的改變。蛋白分子的柔性越好，相應表現出蛋白的乳化特性越好。

圖4 WG與改性蛋白的圓二色光譜Fig. 4 Circular dichroism spectra of natural and modified glutenin

如圖4所示，未改性的WG其二級結構主要為β-折疊，且α-螺旋結構占17.62%，平均是改性蛋白的1.27 倍（表1）。經化學改性的AP、PP與未經改性的WG相比，其α-螺旋結構呈現明顯的下降，而β-折疊結構呈現上升趨勢；β-轉角結構在整體上變化不明顯，無規卷曲結構在一定程度上有所變化。

表1 WG與改性蛋白二級結構變化的對比分析Table 1 Comparative analysis of secondary structures of natural and modified glutenin

2.6 掃描電子顯微鏡對WG與改性蛋白的觀察

圖5 核桃谷蛋白與改性蛋白的SEM圖（×5 000）Fig. 5 SEM photographs of natural and modified glutenin (× 5 000)

由圖5可以看出，未經任何改性處理的WG呈現出圓球狀的小顆粒，并相互呈散落狀，即使有較大塊的顆粒也比較少見；AP與PP，已不見松散的圓形小顆粒，取而代之的是有空隙的、大片或是塊狀的結構。從前后2 種結構可以得出，經酰基化與磷酸化改性處理會使原本球聚的蛋白結構轉向片狀或塊狀的結構，這可能是因為WG由于改性而使得肽鏈展開所形成。而這種展開的表面積增大的結構會更有利于蛋白質溶解度、持水性的提升[31-34]。

2.7 功能指標分析

對改性前后WG加以功能指標的測定，并橫向、縱向對指標進行對比。由表2可知，未改性WG溶解度為17.43%，而改性后AP與PP的溶解度分別為80.29%和95.60%，改性后的AP與PP溶解度分別提升了3.61 倍和4.49 倍；未改性的WG其持水性和持油性分別為4.27 g/g和4.81 g/g；而AP與PP的持水性和持油性分別為12.68、10.90和4.71、3.87，經過改性處理的WG其持水性顯著高于未改性的，持水性提升了1.97 倍和1.55 倍；通過數據表明，谷蛋白的溶解度與持水性有較明顯的相關性，且較高的溶解度對應較高的持水性。這與毛曉英[35]的結論稍有不同，可能是因為單一的谷蛋白與全蛋白或粗蛋白在蛋白結構以及氨基酸組成成分上有不同，因此結論會有一定的差異性。這其中還可能是因為蛋白質分子大小、形狀、蛋白質構象的不同所導致蛋白質中氨基酸以及其側鏈的帶電性不同。經過改性處理的WG其持油性略低于未改性的，持油性降低至未改性的97.92%和80.47%，持油性略有降低；通過酰基化改性的AP其持油性基本上與WG保持一致，而PP的持油性有一定程度的下降，這可能是因為兩種化學改性使得極性氨基酸數量有一定程度的增長，而非極性氨基酸處于減少的狀態，且在制備改性蛋白的過程中，谷蛋白會有一定的微變性，導致親水性氨基酸基團逐步暴露。El Nasri等[36]研究表明，一定的表面積和疏水性可以有助于增大相應的持油性，同時含量較高的蛋白質會相應有較高的持油性。有研究[35-37]指出，葵花籽與大豆蛋白含量的增加可以提高產品的品質，使得產品的持油性有所提高。改性前后WG的持油性均比毛曉英[35]報道的分離和濃縮蛋白高（2.81、2.50 g/g和2.43 g/g），蛋白質的持油性強弱決定了其在肉制品加工過程中，能否增強肉質的乳化程度，改善食用品質口感。通過數據分析，改性后的AP與PP具備高度的持水性和一定的持油能力，這可以為肉及肉制品的加工發揮更大的作用。

經磷酸化處理的PP與WG和酰基化改性AP的乳化性有顯著的不同，PP的乳化性最高為34.38%，表現出了顯著差異（P＜0.05）；而WG與AP的乳化性差異不顯著（P＞0.05）；這一結果基本與葵花籽、腰果等蛋白的測定結果一致。而在乳化穩定性上，經化學改性處理的谷蛋白其穩定性明顯減低，由未改性的64.58%降至38.46%，其差異顯著（P＜0.05）。

在溶解度、疏水性以及黏性等因素中，對于起泡性的變化都有一定的影響，且較大的蛋白分子具有良好的泡沫穩定性。這可能是因為蛋白質分子的肽鏈受到外界環境的干擾，其分子柔性不斷增強，蛋白質能夠向氣-水界面運動效率得到了一定的提升，因此使得起泡性有一定改善[37]。由表2可知，經過改性處理的谷蛋白起泡性并沒有得到一定的改善，但PP的泡沫穩定性是WG的1.2 倍，這種改善效果也并不明顯。

表2 改性前后谷蛋白的功能性質比較Table 2 Comparison of functional properties of natural and modified glutenin

3 結 論

經酰基化處理后的AP溶解度為80.29%；經磷酸化處理后的PP溶解度為95.60%。經琥珀酸酐改性蛋白的酰化程度為（77.26±0.49）%，說明酰化較充分。

熒光強度被影響發生較大變化，且吸收峰出現紅移現象，說明蛋白的親水性與疏水性發生了一定的變化，疏水性快速下降；紫外光譜的最大吸收波長為284 nm，且出現藍移現象，表明了色氨酸以及酪氨酸殘基極性狀態有一定改變；紅外光譜分析疏水性的基團逐漸減少，而親水性的基團逐漸增多；圓二色光譜顯示蛋白的二級結構中，α-螺旋、β-折疊、β-轉角以及無規卷曲結構都有不同程度的變化，表明了蛋白的高級結構發生變化，因而影響到蛋白的溶解度與持水能力有明顯提高；在掃描電子顯微鏡下清晰發現，蛋白的微觀結構以及分布特征發生明顯變化，這也對蛋白的功能特性有相應的影響。