化學(xué)改性對(duì)核桃谷蛋白結(jié)構(gòu)表征及功能特性的影響

孫 乾，張愛(ài)琴，薛雨菲，曹文利，奚鳳玲，王榮浩，李 芳，孔令明,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830021）

核桃（Juglans regia）在我國(guó)多省都有種植。到2016年，我國(guó)核桃種植面積超500萬(wàn) hm2，年產(chǎn)量近300萬(wàn) t，其占經(jīng)濟(jì)類樹(shù)林總面積的15%左右，居世界之首[1]。核桃營(yíng)養(yǎng)豐富，含蛋白15%～20%、含脂肪60%～70%、含人體所必須的多種VA、VE、VD、VK等較高[2]。核桃中的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，是促進(jìn)大腦活性和減緩衰老的健康蛋白[3-4]。目前，核桃的食用性，一般為榨油或直接食用。但對(duì)核桃榨油后副產(chǎn)物的綜合性利用，以及占核桃蛋白總量70%以上的谷蛋白的研究還鮮有報(bào)道，對(duì)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)脫脂、分離、濃縮核桃粉，都缺乏規(guī)模化、科研化、技術(shù)化、集約化的深加工。由相關(guān)的文獻(xiàn)論述[5]，核桃蛋白大部分為谷蛋白，其不溶于水、油，因此，極大限制了核桃蛋白在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。

蛋白質(zhì)的化學(xué)性修飾主要是氨基酸的殘基化修飾，其中分為酰基化、磷酸化、糖基化等反應(yīng)，這些反應(yīng)都是針對(duì)氨基酸殘基上的—COOH、—OH、—NH2和—SH加以改性作用[6]。通過(guò)改性可改善原蛋白的一些功能特性，諸如溶解度、持水（持油）性、乳化特性、熱穩(wěn)定性、表面特性、凝膠性等。常使用的酰化劑有琥珀酸酐、馬來(lái)酸酐等；常用的磷酸鹽有復(fù)合磷酸鹽、三聚磷酸鈉、多聚磷酸鈉等。

有研究者采用不同改性劑對(duì)蛋白進(jìn)行改性，高度的酰基化使蛋白在偏堿性的環(huán)境下溶解度增加，POCl3改善了蛋白結(jié)構(gòu)，提高了蛋白質(zhì)功能特性[7]。磷酸化的改性，使蛋白空間結(jié)構(gòu)得以改變，肽鏈的延展伸縮，溶解度有所提高，隨著溶解度的提高，其乳化性等功能特性以及黏度都有相應(yīng)的提高；劉雯等[8]以提取率為參照指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白改性前后有4.37%和23.46%的提高；奚海燕[9]以磷酸化程度為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)3%的三聚磷酸鈉使大豆蛋白有最大改性。

熒光光譜是研究液態(tài)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的一種方法，其可以通過(guò)對(duì)氨基酸的熒光特性反映蛋白的疏水性，且靈敏度高、方法簡(jiǎn)單、所需樣品量少；紫外分光光度法可研究蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，以及測(cè)定蛋白的溶解度、乳化性等，其靈敏度高、選擇性好、精密度高；傅里葉紅外光譜可以對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在不同環(huán)境下定性和定量分析，其分辨率高、重復(fù)性好、測(cè)量簡(jiǎn)單、掃描較快；圓二色光譜又稱圓二色曲線，遠(yuǎn)紫外區(qū)一般是肽鍵的吸收峰，反映蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象，近紫外區(qū)一般是蛋白質(zhì)的側(cè)鏈基團(tuán)，反映氨基酸及其殘基的細(xì)微構(gòu)象變化。

核桃供應(yīng)量持續(xù)增長(zhǎng)，開(kāi)發(fā)率依然較低，初加工耗時(shí)費(fèi)力，附加值始終不高。因此，為更加有利于核桃資源的開(kāi)發(fā)，實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)方法對(duì)核桃蛋白進(jìn)行改性處理，以此使核桃餅粕中的優(yōu)質(zhì)蛋白得以更加全面的綜合性利用，對(duì)核桃產(chǎn)業(yè)的精深加工意義深遠(yuǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃餅粕（榨油后制得） 新疆中亞食品有限公司；核桃谷蛋白（walnut glutenin，WG）由核桃餅粕制得；大豆油 新疆友好集團(tuán)股份有限公司。

十二烷基硫酸鈉、氯化亞錫（SnCl2·H2O） 北京索來(lái)寶科技有限公司；琥珀酸酐（丁二酸酐） 上海源葉生物科技有限公司；三聚磷酸鈉、無(wú)水乙醚、石油醚（均為分析純） 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀（色譜純） 山東嘉穎化工科技有限公司；2-乙氧基乙醇（分析純） 北京津同樂(lè)泰化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Testo205便攜式數(shù)顯pH計(jì) 德圖儀表（深圳）有限公司；PL203電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TDL-5-A低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；ALPHA 1-2型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司；TU-1810PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SENS-9003型熒光光譜分析儀 北京卓立漢光儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；J-810圓二色光譜儀 日本Jasco公司；JEOL700F掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 WG的制備

工藝流程：核桃餅粕→脫脂核桃粕→加去離子水→離心→沉淀→加NaCl→離心→沉淀→加體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇→離心→沉淀→加NaOH溶液調(diào)pH值→離心→上清液→加HCl溶液調(diào)pH值至等電點(diǎn)→離心→沉淀→水洗至中性→真空冷凍干燥→WG[10]。

1.3.2 改性蛋白的制備

工藝流程：WG→制備溶液→攪拌→調(diào)pH值→加酰化劑（加磷酸鹽）→攪拌→調(diào)pH值→透析→真空冷凍干燥→改性蛋白。

將2.00 g WG分散在30 mL去離子水中，室溫下攪拌1 h，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)不同pH值，然后分批加入一定量的琥珀酸酐（磷酸鹽），反應(yīng)過(guò)程中不斷攪拌，并用1 mol/L HCl或NaOH溶液維持溶液pH 7.0不再變化至終止反應(yīng)（一般為5～60 min）。將酰化蛋白溶液在4 ℃透析48～72 h以滲透壓形式過(guò)濾未反應(yīng)的琥珀酸酐，濃縮溶液后進(jìn)行真空冷凍干燥處理，即為酰化蛋白（acylated protein，AP）。磷酸化蛋白（phosphorylated protein，PP）實(shí)驗(yàn)組不用透析，對(duì)照組不添加任何試劑[11]。

1.3.3 溶解度的測(cè)定

根據(jù)Horax法稍作改動(dòng)[12]。分別稱取0.10 g WG、AP與PP樣品分散于10 mL去離子水中，室溫下磁力攪拌0.5 h左右，溶液以4 500 r/min離心15 min，留取上清液待用；取空試管，加入5 mL考馬斯G-250，加入50 μL去離子水，再加入50 μL上清液，劇烈振蕩1 min左右以混勻；放置10 min，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)量，對(duì)照組加入5 mL考馬斯G-250，再加入100 μL去離子水。蛋白質(zhì)溶解度計(jì)算如式（1）所示：

1.3.4 熒光光譜分析

精確稱取WG和改性蛋白樣品溶解于pH 7.0的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液中，調(diào)蛋白質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL。在25 ℃條件下放置3 h，采用熒光光譜分析儀測(cè)定WG、AP與PP的樣品熒光特性。取約5 mL樣液置于四通石英比色皿中，選擇熒光光譜的激發(fā)波長(zhǎng)為310 nm，發(fā)射光譜的波長(zhǎng)掃描范圍為410～460 nm，選擇狹縫為5 nm，每個(gè)樣液重復(fù)掃描3 次。

1.3.5 紫外光譜分析

精確稱取WG、AP與PP樣品溶解于pH 7.0的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液中，調(diào)蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。取約5 mL樣液置于置于1 cm的石英比色皿，用分光光度計(jì)測(cè)定樣品的吸光度，樣品的掃描波長(zhǎng)范圍為200～400 nm[13]。

1.3.6 紅外光譜分析

精確稱取WG、AP與PP樣品1 mg加入溴化鉀進(jìn)行緩慢研磨至均一的粉末狀，在模具中以8 MPa壓制2～3 min制成薄片。采用傅里葉變換紅外光譜儀在（4 000～400 cm-1）全波段上掃描，分辨率4 cm-1，波數(shù)精度0.01 cm-1，掃描次數(shù)32[14]。

1.3.7 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的圓二色光譜分析

精確稱取WG、AP與PP樣品溶解于pH 7.0的磷酸緩沖液中，調(diào)蛋白質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL。在25 ℃條件下放置3 h，采用圓二色光譜儀測(cè)定WG的圓二色性。取約5 mL樣液置于2 mm石英比色皿中，選擇掃描的波長(zhǎng)為190～250 nm，掃描速率為100 nm/min，響應(yīng)溫度為25 ℃，靈敏度為100 mdeg/cm，分辨率為0.5 nm。所測(cè)出的圖譜需扣除緩沖液的空白差，每個(gè)樣液重復(fù)掃描8 次取平均值，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)采用JASCO結(jié)構(gòu)軟件進(jìn)行分析，圓二色性以殘基摩爾橢圓率表示（℃·cm2/dmol）。

1.3.8 掃描電子顯微鏡觀察

取WG、AP與PP的粉末樣品進(jìn)行噴金處理，將樣品處理好之后加壓至20 kV，用掃描電子顯微鏡觀察[15]。

1.3.9 酰化度的測(cè)定

采用茚三酮法進(jìn)行測(cè)定，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的WG、AP與PP樣液，取空試管，加入1 mL樣液，再加入0.02 g/mL茚三酮溶液1 mL，蓋塞搖勻；混合液于100 ℃水浴上加熱10～15 min，取出后在20～25 ℃的水浴中冷卻，加入5 mL去離子水，盡快在波長(zhǎng)570 nm波長(zhǎng)處測(cè)量。對(duì)照組以0.02 g/mL茚三酮溶液作空白。酰化度計(jì)算如式（2）所示：

1.3.10 持水性的測(cè)定

參考Paredeslopez等[16]的研究并作一定修改。準(zhǔn)確稱取0.10 g的WG、AP與PP粉末置于離心管中，加入10 mL去離子水，使用離心機(jī)4 500 r/min離心15 min。稱取樣品和離心管質(zhì)量，持水性計(jì)算如式（3）所示：

式中：M0為樣品質(zhì)量/g；M1為離心管與樣品總質(zhì)量/g；M2為離心管與沉淀物質(zhì)量/g。

1.3.11 持油性的測(cè)定

依照Pedroche等[17]的研究并作一定的調(diào)整，準(zhǔn)確稱取0.10 g的WG、AP與PP樣品置于離心管中，加入大豆油5 mL，旋渦式振動(dòng)60 s，然后3 300 r/min離心15 min，吸紙吸去殘留油脂，持油性計(jì)算如式（4）所示：

式中：M0為樣品質(zhì)量/g；M1為離心管與樣品總質(zhì)量/g；M2為吸油后離心管與樣品總質(zhì)量/g。

1.3.12 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

取空試管，加入5 mL蛋白樣液，加入25 mL去離子水，再加入20 mL大豆油，旋渦式振動(dòng)60 s，然后2 500 r/min離心乳化5 min，分辨乳化層[18]。乳化性計(jì)算如式（5）所示：

精確稱取5 g樣品溶于100 mL去離子水中，調(diào)節(jié)至pH 7.0，加入50 mL大豆油，高速乳化均質(zhì)1 min左右；放置于45 ℃水浴中45 min左右，測(cè)量乳化層的高度（H0），30 min后再次測(cè)量乳化層的高度（H1）[19]。乳化穩(wěn)定性計(jì)算如式（6）所示：

1.3.13 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

精確稱取WG、AP與PP樣品溶解于pH 7.0的磷酸緩沖液中，取空試管，加入10.0 mL樣液（V0），高速乳化均質(zhì)2 min左右；迅速測(cè)量總體積（V1），30 min再次測(cè)量總體積（V2）[20]。起泡性與泡沫穩(wěn)定性計(jì)算如式（7）和式（8）所示：

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 次重復(fù)。運(yùn)用Excel 2003進(jìn)行圖形繪制，光譜圖采用系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酰化度的測(cè)定結(jié)果

酰化蛋白樣品實(shí)驗(yàn)根據(jù)式（2）中對(duì)酰化程度加以計(jì)算得知，經(jīng)琥珀酸酐（丁二酸酐）改性的AP其酰化度為（77.26±0.49）%。吸光度的百分?jǐn)?shù)表示游離氨基與茚三酮溶液的反應(yīng)程度，吸光度越高，反應(yīng)程度越高，酰化度越低。因此經(jīng)琥珀酸酐改性后的WG其被酰化的程度較高，說(shuō)明酰化較充分。

2.2 熒光光譜分析

使用熒光分光光度計(jì)對(duì)WG、AP和PP進(jìn)行掃描測(cè)定。在310 nm的激發(fā)波長(zhǎng)處所產(chǎn)生的熒光光譜主要是由于谷蛋白中存在一定量的色氨酸所造成的，譜圖上顯示的熒光峰實(shí)質(zhì)為色氨酸基團(tuán)由于光激發(fā)產(chǎn)生的電子躍遷所導(dǎo)致，峰的位置在428～431 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)（圖1），AP與PP的化學(xué)改性可能是由于改變了蛋白質(zhì)中的氫鍵，使得部分氫鍵產(chǎn)生斷裂，而蛋白分子內(nèi)部的氫鍵是決定蛋白質(zhì)分子中α-螺旋和β-折疊穩(wěn)定性的重要因素，氫鍵的破裂會(huì)導(dǎo)致蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定。熒光強(qiáng)度的改變也說(shuō)明了色氨酸在改性后出現(xiàn)大量的衰減，且改性蛋白的最大吸收峰強(qiáng)度也發(fā)生了輕微的紅移。蛋白分子逐漸展開(kāi)分子鏈，將更多的親水性基團(tuán)暴露出來(lái)，使得親水性極大增強(qiáng)，從而使溶解度有極大的提高[21-22]。

圖1 WG與改性蛋白的熒光光譜Fig. 1 Fluorescence spectra of natural and modified glutenin

2.3 紫外光譜分析

蛋白的紫外吸收最為關(guān)鍵在于蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基所引起，此3 種氨基酸在蛋白中的存在以及存在的數(shù)量性直接決定了蛋白的紫外吸收強(qiáng)度水平。在另一種意義上也與組氨酸和半胱氨酸基團(tuán)有關(guān)，但相關(guān)性要弱于前3 個(gè)氨基酸。由圖2可知，WG的最大紫外吸收波長(zhǎng)為280 nm，這反映了WG的紫外吸收主要是由于其蛋白內(nèi)的色氨酸和酪氨酸殘基引起的[23]。由圖2所示，當(dāng)進(jìn)行酰基化和磷酸化處理時(shí)，AP與PP的紫外吸收明顯增強(qiáng)，且這種增強(qiáng)極顯著（P＜0.05）；WG的最高紫外吸收峰出現(xiàn)在280 nm波長(zhǎng)處的0.44，而AP與PP的最高紫外吸收峰分別出現(xiàn)在282 nm與283 nm波長(zhǎng)處，且吸光度分別為1.69和1.44。經(jīng)AP與PP處理的蛋白，其兩者之間的差異并不顯著（P＞0.05）。

隨著化學(xué)改性的處理，所有改性蛋白的吸收峰均出現(xiàn)在275～279 nm之間，蛋白紫外吸收峰出現(xiàn)藍(lán)移，說(shuō)明色氨酸、酪氨酸等殘基基團(tuán)所處微環(huán)境的極性狀態(tài)發(fā)生了改變，這種改變也相應(yīng)會(huì)引起肽鍵的斷裂，而肽鏈上的色氨酸、酪氨酸殘基屬于極性氨基酸，所帶的雜環(huán)π→π*電子躍遷是引發(fā)紫外吸收的關(guān)鍵因素，蛋白質(zhì)肽鏈的逐漸展開(kāi)，π→π*和n→π*電子的躍遷能量逐漸增大，也導(dǎo)致了紫外吸收的相對(duì)增強(qiáng)[24]。

圖2 WG與改性蛋白的紫外光譜Fig. 2 UV absorption spectra of natural and modified glutenin

2.4 紅外光譜分析

蛋白質(zhì)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)通常包括α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲。在酰胺I帶上是蛋白不同二級(jí)結(jié)構(gòu)信息的疊加，對(duì)譜圖可以進(jìn)行線性擬合以確定出結(jié)構(gòu)與峰形之間的相對(duì)應(yīng)關(guān)系。在1 700～1 600 cm-1的酰胺I帶一般是蛋白質(zhì)所在的特征峰，也常用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，這主要是由于蛋白質(zhì)中含有C—O鍵伸縮振動(dòng)所形成的，也正是因?yàn)檫@樣，此處的信號(hào)較強(qiáng)[25-27]。蛋白質(zhì)作為兩親性結(jié)構(gòu)的代表，疏水性和親水性是決定其乳化性的一個(gè)重要指標(biāo)。

WG主要由其中的谷蛋白組成，這也使得WG持水能力較差，而相比持油性較為穩(wěn)定，因受到化學(xué)改性的作用，改性蛋白在空間結(jié)構(gòu)上受到較大破壞，大量的親水性基團(tuán)暴露，這也使得WG的親水性有很大的提高。

由圖3可以看出，經(jīng)過(guò)化學(xué)改性處理的蛋白，其波形均向高波數(shù)藍(lán)移了約0.5～1 cm-1。這說(shuō)明蛋白在受到化學(xué)劑的影響下，其結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，原本的結(jié)構(gòu)開(kāi)始逐漸解離。當(dāng)氫鍵作用較弱化時(shí)，C＝O的電子云密度逐漸升高，導(dǎo)致吸收峰位向高波數(shù)方向藍(lán)移。由圖3還可以發(fā)現(xiàn)，在改性后的蛋白中，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量有一定的升高；相應(yīng)的無(wú)規(guī)卷曲與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，基本沒(méi)有變化；β-折疊結(jié)構(gòu)含量有一定的上升，這些都表明了核桃蛋白在受到化學(xué)改性后，其疏水性的基團(tuán)逐漸減少，而親水性的基團(tuán)逐漸增多[28]。α-螺旋和β-折疊是有序的蛋白結(jié)構(gòu)，具有一定的穩(wěn)定性；而β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲則是無(wú)序的蛋白結(jié)構(gòu)，其會(huì)較易發(fā)生改變。由于化學(xué)作用，會(huì)產(chǎn)生一定數(shù)量的—OH和—COOH，這在一定程度上使得β-折疊結(jié)構(gòu)被破壞，并與α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角之間相互轉(zhuǎn)化[29]。

圖3 WG與改性蛋白的紅外光譜Fig. 3 Infrared spectra of natural and modified glutenin

2.5 圓二色光譜分析

圓二色光譜常被用作定量分析植物性蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成，且可分為遠(yuǎn)紫外和近紫外兩個(gè)區(qū)域，遠(yuǎn)紫外區(qū)是肽鍵所在的吸收范圍，其能夠較為直觀地反映肽鏈結(jié)構(gòu)。在遠(yuǎn)紫外光區(qū)，210 nm波長(zhǎng)處的負(fù)峰顯示具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，而α-螺旋結(jié)構(gòu)過(guò)于穩(wěn)定，在一定程度上會(huì)阻止蛋白的構(gòu)象受到改變，蛋白質(zhì)趨于穩(wěn)定狀態(tài)，不利于蛋白功能特性的改變[30]；相比α-螺旋結(jié)構(gòu)，β-折疊與無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)使得蛋白穩(wěn)定性較差，從而促使蛋白的柔性以及功能特性有良好的改變。蛋白分子的柔性越好，相應(yīng)表現(xiàn)出蛋白的乳化特性越好。

圖4 WG與改性蛋白的圓二色光譜Fig. 4 Circular dichroism spectra of natural and modified glutenin

如圖4所示，未改性的WG其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β-折疊，且α-螺旋結(jié)構(gòu)占17.62%，平均是改性蛋白的1.27 倍（表1）。經(jīng)化學(xué)改性的AP、PP與未經(jīng)改性的WG相比，其α-螺旋結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的下降，而β-折疊結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在整體上變化不明顯，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)在一定程度上有所變化。

表1 WG與改性蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的對(duì)比分析Table 1 Comparative analysis of secondary structures of natural and modified glutenin

2.6 掃描電子顯微鏡對(duì)WG與改性蛋白的觀察

圖5 核桃谷蛋白與改性蛋白的SEM圖（×5 000）Fig. 5 SEM photographs of natural and modified glutenin (× 5 000)

由圖5可以看出，未經(jīng)任何改性處理的WG呈現(xiàn)出圓球狀的小顆粒，并相互呈散落狀，即使有較大塊的顆粒也比較少見(jiàn)；AP與PP，已不見(jiàn)松散的圓形小顆粒，取而代之的是有空隙的、大片或是塊狀的結(jié)構(gòu)。從前后2 種結(jié)構(gòu)可以得出，經(jīng)酰基化與磷酸化改性處理會(huì)使原本球聚的蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向片狀或塊狀的結(jié)構(gòu)，這可能是因?yàn)閃G由于改性而使得肽鏈展開(kāi)所形成。而這種展開(kāi)的表面積增大的結(jié)構(gòu)會(huì)更有利于蛋白質(zhì)溶解度、持水性的提升[31-34]。

2.7 功能指標(biāo)分析

對(duì)改性前后WG加以功能指標(biāo)的測(cè)定，并橫向、縱向?qū)χ笜?biāo)進(jìn)行對(duì)比。由表2可知，未改性WG溶解度為17.43%，而改性后AP與PP的溶解度分別為80.29%和95.60%，改性后的AP與PP溶解度分別提升了3.61 倍和4.49 倍；未改性的WG其持水性和持油性分別為4.27 g/g和4.81 g/g；而AP與PP的持水性和持油性分別為12.68、10.90和4.71、3.87，經(jīng)過(guò)改性處理的WG其持水性顯著高于未改性的，持水性提升了1.97 倍和1.55 倍；通過(guò)數(shù)據(jù)表明，谷蛋白的溶解度與持水性有較明顯的相關(guān)性，且較高的溶解度對(duì)應(yīng)較高的持水性。這與毛曉英[35]的結(jié)論稍有不同，可能是因?yàn)閱我坏墓鹊鞍着c全蛋白或粗蛋白在蛋白結(jié)構(gòu)以及氨基酸組成成分上有不同，因此結(jié)論會(huì)有一定的差異性。這其中還可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子大小、形狀、蛋白質(zhì)構(gòu)象的不同所導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸以及其側(cè)鏈的帶電性不同。經(jīng)過(guò)改性處理的WG其持油性略低于未改性的，持油性降低至未改性的97.92%和80.47%，持油性略有降低；通過(guò)酰基化改性的AP其持油性基本上與WG保持一致，而PP的持油性有一定程度的下降，這可能是因?yàn)閮煞N化學(xué)改性使得極性氨基酸數(shù)量有一定程度的增長(zhǎng)，而非極性氨基酸處于減少的狀態(tài)，且在制備改性蛋白的過(guò)程中，谷蛋白會(huì)有一定的微變性，導(dǎo)致親水性氨基酸基團(tuán)逐步暴露。El Nasri等[36]研究表明，一定的表面積和疏水性可以有助于增大相應(yīng)的持油性，同時(shí)含量較高的蛋白質(zhì)會(huì)相應(yīng)有較高的持油性。有研究[35-37]指出，葵花籽與大豆蛋白含量的增加可以提高產(chǎn)品的品質(zhì)，使得產(chǎn)品的持油性有所提高。改性前后WG的持油性均比毛曉英[35]報(bào)道的分離和濃縮蛋白高（2.81、2.50 g/g和2.43 g/g），蛋白質(zhì)的持油性強(qiáng)弱決定了其在肉制品加工過(guò)程中，能否增強(qiáng)肉質(zhì)的乳化程度，改善食用品質(zhì)口感。通過(guò)數(shù)據(jù)分析，改性后的AP與PP具備高度的持水性和一定的持油能力，這可以為肉及肉制品的加工發(fā)揮更大的作用。

經(jīng)磷酸化處理的PP與WG和酰基化改性AP的乳化性有顯著的不同，PP的乳化性最高為34.38%，表現(xiàn)出了顯著差異（P＜0.05）；而WG與AP的乳化性差異不顯著（P＞0.05）；這一結(jié)果基本與葵花籽、腰果等蛋白的測(cè)定結(jié)果一致。而在乳化穩(wěn)定性上，經(jīng)化學(xué)改性處理的谷蛋白其穩(wěn)定性明顯減低，由未改性的64.58%降至38.46%，其差異顯著（P＜0.05）。

在溶解度、疏水性以及黏性等因素中，對(duì)于起泡性的變化都有一定的影響，且較大的蛋白分子具有良好的泡沫穩(wěn)定性。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子的肽鏈?zhǔn)艿酵饨绛h(huán)境的干擾，其分子柔性不斷增強(qiáng)，蛋白質(zhì)能夠向氣-水界面運(yùn)動(dòng)效率得到了一定的提升，因此使得起泡性有一定改善[37]。由表2可知，經(jīng)過(guò)改性處理的谷蛋白起泡性并沒(méi)有得到一定的改善，但PP的泡沫穩(wěn)定性是WG的1.2 倍，這種改善效果也并不明顯。

表2 改性前后谷蛋白的功能性質(zhì)比較Table 2 Comparison of functional properties of natural and modified glutenin

3 結(jié) 論

經(jīng)酰基化處理后的AP溶解度為80.29%；經(jīng)磷酸化處理后的PP溶解度為95.60%。經(jīng)琥珀酸酐改性蛋白的酰化程度為（77.26±0.49）%，說(shuō)明酰化較充分。

熒光強(qiáng)度被影響發(fā)生較大變化，且吸收峰出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，說(shuō)明蛋白的親水性與疏水性發(fā)生了一定的變化，疏水性快速下降；紫外光譜的最大吸收波長(zhǎng)為284 nm，且出現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象，表明了色氨酸以及酪氨酸殘基極性狀態(tài)有一定改變；紅外光譜分析疏水性的基團(tuán)逐漸減少，而親水性的基團(tuán)逐漸增多；圓二色光譜顯示蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)都有不同程度的變化，表明了蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因而影響到蛋白的溶解度與持水能力有明顯提高；在掃描電子顯微鏡下清晰發(fā)現(xiàn)，蛋白的微觀結(jié)構(gòu)以及分布特征發(fā)生明顯變化，這也對(duì)蛋白的功能特性有相應(yīng)的影響。