辛烯基琥珀酸納米淀粉酯顆粒的制備及其食品級Pickering 乳液的特性

王 然

（1.長春職業技術學院食品與生物技術分院，吉林 長春 130033；2.吉林大學生物與農業工程學院，吉林 長春 130022）

Pickering乳液是采用納米級或微米級的固體顆粒替代傳統乳化劑，這些顆粒能吸附在油水界面上，并在油滴之間形成一道物理屏障，抑制油滴聚結，進而形成相對穩定的分散體系[1-2]。近十年，Pickering乳液的研究已經從應用無機顆粒（例如二氧化硅粒子、碳酸鈣粒子和二氧化鈦粒子等）發展到應用有機顆粒，有機顆粒包括碳水化合物類顆粒、脂類顆粒、蛋白質類顆粒等，其中食品級顆粒穩定的Pickering乳液成為近年的研究熱點。Tan Ying等[3]研究采用乙酸酐和鄰苯二甲酸酐相繼與淀粉分子發生酯化反應，使淀粉納米顆粒能夠穩定水包油或油包水2 種類型的乳液；Liu Fu等[4]研究利用大豆蛋白納米聚集體制備水包油型乳液，其中乳液中油滴的直徑超過35 μm；Doki?等[5]研究利用辛烯基琥珀酸酐（octenyl succinic anhydride，OSA）與蠟質淀粉發生酯化反應，再將制成的酯化淀粉代替乳化劑應用于制備水包油型乳液。Matos等[6]研究利用藜麥淀粉球制備水包油包水型多相Pickering乳液。

目前應用于Pickering乳液的食品級顆粒，在制備過程中，往往需要利用化學試劑對其進行改性處理，這難免存在化學試劑殘留的問題，因此無法直接應用于食品加工中。然而，淀粉顆粒由于其良好的適應性和無毒性而廣泛應用于Pickering乳液的制備[7]，同時，OSA淀粉酯為GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》明確規定可以作為乳化劑應用于食品工業。本研究采用OSA與玉米淀粉納米顆粒發生酯化反應，制成具有親油性的納米淀粉酯顆粒，在制備過程中所有參與反應的試劑均為食品工業生產允許使用的試劑，制成的顆?？梢灾苯討糜谑称芳塒ickering乳液的制備；為增進Pickering乳液的穩定性，本實驗探討Pickering乳液的制備條件，分析體系顆粒濃度、pH值、離子強度等條件對乳液穩定性的影響，為開發食品級Pickering乳液提供一種安全、有效的固體顆粒和簡易、可行的制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉（包含淀粉99.5%、蛋白質0.3%、脂肪0.1%、灰分0.1%和水分4.8%） 長春大成實業集團有限公司；OSA、羅丹明B 美國西格瑪奧德里奇貿易有限公司；玉米油 九三糧油工業集團有限公司；去離子水杭州娃哈哈集團有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Zetasizer Nano ZS90激光納米粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；HN-1000Y超聲波細胞破碎儀 上海汗諾儀器有限公司；IRAffinity-1傅里葉變換紅外光譜儀島津企業管理（中國）有限公司；IX81倒置熒光顯微鏡奧林巴斯（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米淀粉納米顆粒的制備

參考Dong Yan等[8]的方法稍作修改。將玉米淀粉與去離子水配制成1∶50（g/mL）的懸浮液，然后將懸浮液置于100 ℃恒溫水浴中，以60 r/min攪拌1 h，停止加熱并持續攪拌，在室溫條件下冷卻至25 ℃，得到淀粉膠狀液。將淀粉膠狀液以1∶200（V/V）的比例滴加至無水乙醇中，并以200 r/min的速率持續攪拌，滴加完成后，將上述液體置于離心機中，3 500 r/min離心5 min，倒掉上清液，將沉淀物用無水乙醇洗2 遍，然后于-70 ℃凍干，即得到玉米淀粉納米顆粒。

1.3.2 辛烯基琥珀酸納米淀粉酯顆粒的制備

參考Bhosale等[9]的方法并適當修改。將玉米淀粉納米顆粒與體積分數85%的乙醇溶液配制成1∶5（g/mL）的懸浮液。用質量分數為3%的NaOH溶液將懸浮液的pH值調至8.5±0.5，然后分5 次滴加質量濃度為3 g/100 mL的OSA并在30 ℃下持續攪拌（100 r/min）6 h，在此過程中，保持體系pH值處于8.5±0.5范圍內。用體積分數3%的HCl溶液將上述懸浮液的pH值調制至6.5±0.5，3 500 r/min離心5 min，去上清液，將沉淀物用去離子水洗2 遍，再用體積分數70%的乙醇溶液洗2 遍，最后于-70 ℃凍干，即得到辛烯基琥珀酸納米淀粉酯顆粒（簡稱納米淀粉酯）。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜的測定

利用傅里葉變換紅外光譜對納米淀粉酯化學結構的改變進行鑒定。將納米淀粉酯粉末在真空條件下干燥至恒質量，然后將納米淀粉酯粉末與KBr（光譜純）以1∶75（m/m）的比例混合并壓制成片狀，使用紅外光譜儀在波長4 000～400 cm-1范圍內進行光譜掃描，設置光譜分辨率4 cm-1，經32 次掃描獲得樣品譜圖。

1.3.4 納米淀粉酯粒度分布的測定

將納米淀粉酯與去離子水配制成3∶1 000（g/mL）的懸浮液，超聲處理15 min，再將其置于激光納米粒度儀中，對納米淀粉酯的粒度分布進行檢測，設置分散劑為水，顆粒折光率為1.530，在20 ℃下檢測3 次，取平均值。

1.3.5 納米淀粉酯Zeta電位的測定

將納米淀粉酯以3∶1 000（g/mL）的比例置于去離子水中，超聲處理15 min，再將其置于激光納米粒度儀中，對納米淀粉酯Zeta電位進行檢測。在KCl濃度為0.05 mol/L條件下，研究不同pH值（3.0～9.0）對納米淀粉酯Zeta電位的影響；同時，在pH 7.0條件下，研究不同KCl濃度（0.001～0.2 mol/L）對納米淀粉酯Zeta電位的影響。

1.3.6 Pickering乳液的制備及穩定性測定

將納米淀粉酯按照一定的比例置于玉米油中，利用超聲波細胞破碎儀，在功率60 Hz下超聲處理1 min，再將玉米油以1∶10（V/V）的比例加入去離子水中，采用間歇式超聲處理30 min，制得納米淀粉酯添加量分別為0.5、1.25、2.0 g/100 mL 3 個梯度的Pickering乳液。

分別取納米淀粉酯添加量2.0 g/100 mL、KCl濃度0.005 mol/L制備Pickering乳液，在pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0 4 個梯度下測定Pickering乳液穩定性的變化趨勢；取納米淀粉酯添加量2.0 g/100 mL，并在pH 7.0以及KCl濃度分別為0.005、0.01、0.05 mol/L和0.1 mol/L 4 個梯度下測定Pickering乳液穩定性的變化趨勢。

1.3.7 Pickering乳液的微觀結構

將熒光染色劑羅丹明B以1∶1（V/V）的比例溶解于去離子水中，再將其稀釋1 000 倍，可對Pickering乳液樣品中的納米淀粉酯進行染色。具體方法如下：取Pickering乳液樣品1 mL，加入上述稀釋染色液0.5 mL，避光攪拌5 min。取潔凈載玻片，將經染色處理后的乳液10 μL滴加到載玻片上，加蓋潔凈的蓋玻片，于倒置熒光顯微鏡載物臺上進行觀察。

1.4 數據統計

全部實驗重復測定3 次，取平均值。淀粉納米酯粒徑分布、Pickering乳液分散相油滴尺寸均采用儀器自帶軟件進行測量和分析，利用Origin 8.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 納米淀粉酯的表征

圖1 玉米淀粉納米顆粒（a）與納米淀粉酯（b）的紅外光譜圖Fig. 1 Infrared spectra of corn starch nanoparticles (a) and starch ester nanoparticles (b)

玉米淀粉與OSA進行酯化反應生成辛烯基琥珀酸淀粉酯，其是GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中批準使用的食品添加劑。在反應過程中，琥珀酸酐上的羰基取代淀粉分子上的羥基進而完成酯化反應，因此，采用傅里變換葉紅外光譜對淀粉分子結構進行檢測，以確定淀粉分子中是否引入了羰基基團。如圖1所示，玉米淀粉納米顆粒在波數為3 408 cm-1和2 933 cm-1處均有特征吸收峰，這分別是由葡萄糖基上O—H的伸縮振動和C—H的伸縮振動生成的；此外，玉米淀粉納米顆粒在波長1 647 cm-1處有特征吸收峰，這是由淀粉中殘存的結合水導致的；玉米淀粉納米顆粒在波數為929 cm-1和1 157 cm-1處均有特征吸收峰，這是由C—O的伸縮振動生成的[10-11]。與玉米淀粉納米顆粒紅外譜圖相比，納米淀粉酯在波數為1 568 cm-1和1 720 cm-1處出現2 個新的特征吸收峰，前者是由于羧基的不對稱伸縮振動而產生的[12]；后者是C＝O的伸縮振動產生的，這說明玉米淀粉納米顆粒與OSA完成了酯化反應中羥基的取代，生成了酯羰基[13]。

2.2 納米淀粉酯粒徑分布

圖2 納米淀粉酯粒徑分布Fig. 2 Size distribution of starch ester nanoparticles

由圖2可以看出，納米淀粉酯的粒徑主要分布在100～550 nm范圍內，呈單峰分布，大多數納米淀粉酯的粒徑集中分布在210～220 nm，這是由于本研究采用醇沉法[14]作為玉米淀粉納米顆粒的制備方法，研究發現，在將玉米淀粉膠狀液滴加到無水乙醇的過程中，無水乙醇體積對制成的玉米淀粉納米顆粒的粒徑具有顯著影響：在一定范圍內，無水乙醇所占的比例越高，制成的玉米淀粉納米顆粒的粒徑越?。幌喾?，無水乙醇所占的比例越低，制成的玉米淀粉納米顆粒的粒徑越大[15-16]。因此，本研究通過控制醇沉實驗中無水乙醇的體積，獲得合適粒徑的玉米淀粉納米顆粒，其中多數顆粒粒度分布為210～220 nm。由于顆粒粒徑是Pickering乳液制備的重要因素之一，所以具有合適粒徑的納米淀粉酯是Pickering乳液制備的必要條件[17-18]。

2.3 pH值對納米淀粉酯Zeta電位的影響

圖3 pH值對納米淀粉酯Zeta電位的影響Fig. 3 Zeta potential of starch ester nanoparticles at different pH values

如圖3所示，在體系pH值由3.0升高至9.0過程中，納米淀粉酯所帶負電荷的數量呈現不同幅度的增加趨勢；當pH 3.0時，納米淀粉酯所帶的負電荷最少（-1.01±0.31）mV；隨著pH值的升高，納米淀粉酯所帶的負電荷逐漸增多；當pH增加至8.0時，納米淀粉酯所帶的負電荷最多（-5.69±0.19）mV；當pH值為9.0時，納米淀粉酯所帶的負電荷數稍有降低（-5.39±0.27）mV；這是由于玉米淀粉納米顆粒的酯化改性是在堿性條件下完成，酯化反應為玉米淀粉納米顆粒的表面連接了烯基基團，致使淀粉納米顆粒帶負電[19]。隨著pH值的增加，納米淀粉酯所帶負電荷的數量增加，這可能是由于納米淀粉酯表面的羧酸基團發生去質子化反應導致的[20]。Kargar[21]和Yu Dehai[22]等分別研究了微晶纖維素和氟化鈉改性的蒙脫土，均發現顆粒的電位隨體系pH值改變而改變，這與本實驗納米淀粉酯所帶電荷變化趨勢一致。

2.4 KCl濃度對納米淀粉酯電位的影響

圖4 KCl濃度對納米淀粉酯Zeta電位的影響Fig. 4 Zeta potential of starch ester nanoparticles at different KCl concentrations

如圖4所示，在pH 7.0條件下，體系中KCl的濃度由0 mol/L增加至0.2 mol/L過程中，隨著KCl濃度的增加，納米淀粉酯所帶負電荷數發生了顯著的下降；當KCl濃度為0 mol/L時，納米淀粉酯所帶的負電荷最多（-25.23±0.53）mV，主要因為在離子強度相對較低并且pH 7.0條件下，納米淀粉酯表面電荷的作用力以靜電斥力主導，靜電斥力在維持Pickering乳液穩定性方面起著至關重要的作用[23-24]。隨著KCl濃度的增加，納米淀粉酯所帶的負電荷逐漸降低，當KCl濃度增加至0.1 mol/L時，納米淀粉酯所帶的負電荷最少（-3.41±0.27）mV；繼續增加KCl濃度，納米淀粉酯所帶電荷數變化不明顯，說明KCl濃度超過0.1 mol/L即能達到屏蔽納米淀粉酯表面電荷的效果。

2.5 納米淀粉酯添加量對Pickering乳液穩定性的影響

相關研究表明，Pickering乳液中顆粒含量變化對其分散相油滴的尺寸具有重要的影響，適宜的顆粒含量對于維持乳液穩定性、防止乳析、聚結等不穩定現象的發生起著重要的作用[25]。如圖5所示，納米淀粉酯的添加量對乳液體系穩定性具有顯著影響。由圖6可知，當體系中納米淀粉酯的添加量由0.5 g/100 mL增加至2.0 g/100 mL時，乳液體系中分散相油滴直徑呈明顯下降趨勢；其中，當納米淀粉酯添加量為0.5 g/100 mL時，乳液體系出現大量直徑超過20 μm的油滴（圖6a）；由于油滴直徑與上浮速度成正比，所以，在這種乳液體系中，油脂更傾向于聚集、上浮，進而導致油水分離的現象發生（圖5）。當納米淀粉酯的添加量增加至1.25 g/100 mL時，乳液體系中直徑超過20 μm的油滴數量明顯減少（圖6b）；當納米淀粉酯的添加量增加至2.0 g/100 mL時，乳液體系中分散相油滴的直徑大幅度下降，在顯微鏡視野里沒有發現直徑超過20 μm的油滴，絕大多數油滴的直徑均小于1 μm，并且呈均勻分布狀態（圖6c）。為觀察納米淀粉酯在乳液體系中的分布情況，進而研究其在Pickering乳液穩定性方面所發揮的作用，本研究采用熒光顏色劑羅丹明B與納米淀粉酯共價相連，使納米淀粉酯顯紅色。如圖6d所示，在熒光顯微鏡視野下，分布著大量紅色圓環，此紅色圓環為羅丹明B標記的納米淀粉酯，這些納米淀粉酯在油滴表面形成了一道致密的屏障，緊密的包裹著分散相油滴，阻礙油滴之間發生聚結。有研究表明，OSA酯化反應不僅使玉米淀粉納米顆粒獲得了疏水基團，而且使其具備一定的表面活性[26]。Wu Jiangde等[27]研究發現在一定范圍內增加顆粒添加量能夠提高Pickering乳液的穩定性。本研究制備的納米淀粉酯能夠吸附于油水界面，并且添加量為2.0 g/100 mL的納米淀粉酯能夠完全的覆蓋在油水界面上，在分散相油滴之間形成物理屏障，抑制油脂聚結，有效發揮穩定Pickering乳液的作用。

圖5 不同添加量納米淀粉酯穩定的食品級Pickering乳液Fig. 5 Food-grade Pickering emulsions stabilized by nanometer starch esters

圖6 不同添加量的納米淀粉酯顆粒穩定的Pickering乳液的顯微鏡觀察圖Fig. 6 Optical microscopic images of Pickering emulsions stabilized by starch ester nanoparticles at different concentrations

2.6 體系pH值對Pickering乳液穩定性的影響

圖7 pH值對食品級Pickering乳液穩定性的影響Fig. 7 Stability of food-grade Pickering emulsions at different pH values

圖8 pH值對食品級Pickering乳液穩定性影響的光學顯微鏡觀察圖Fig. 8 Optical microscopic images of food-grade Pickering emulsions at different pH values

如圖7所示，當pH值為5.0時，Pickering乳液發生明顯的油水分離現象。由圖8可知，體系pH值由5.0升高至8.0時，乳液體系中分散相油滴的直徑發生明顯變化；當pH值為5.0時，乳液體系中分布著數量較多的大油滴，其中最大油滴的直徑可達13.31 μm；當pH值升高至6.0時，體系中油滴的直徑發生大幅度下降，其中最大油滴的直徑僅為3.33 μm，并且呈均勻分布狀態；繼續升高pH值至7.0，發現體系中的油滴直徑開始變大，其中最大的油滴直徑為7.17 μm；繼續升高體系pH值至8.0，體系中再次出現大量的直徑較大的油滴，其中直徑最大為14.85 μm。有研究表明，體系pH值的變化能影響顆粒表面離子基團的電荷數，進而控制顆粒的疏水性，對Pickering乳液的穩定性具有重要的作用。當體系pH值為5.0時，納米淀粉酯所帶的負電荷極少，僅為-2.37 mV（圖3），這導致納米淀粉酯和油水界面之間的靜電吸引力降低，這會阻礙納米淀粉酯吸附到油水界面上，進而不能維持Pickering乳液的穩定，因此，發生明顯的乳析現象（圖7）。然而，當pH值升高至8.0時，納米淀粉酯易發生聚集、沉淀，因此不能有效吸附到油水界面上，使Pickering乳液的失去穩定性。Yang Fei等[28]研究發現在一定范圍內增加體系pH值能夠增加油水界面負電荷數，并能降低顆粒之間的靜電斥力，有助于顆粒吸附到油水界面，增強乳液的穩定性。

2.7 離子強度對Pickering乳液穩定性的影響

圖9 KCl濃度對食品級Pickering乳液穩定性的影響Fig. 9 Stability of food-grade Pickering emulsions at different KCl concentrations

圖10 KCl濃度對食品級Pickering乳液穩定性影響的顯微鏡圖Fig. 10 Optical microscopic images of food-grade Pickering emulsions at KCl concentrations

在乳液體系中，離子強度能夠通過靜電屏蔽作用降低油滴之間的靜電斥力，進而降低乳液的穩定性。如圖9、10所示，在KCl濃度由0.005 mol/L增加至0.01 mol/L過程中，乳液中分散相油滴的直徑發生顯著增加，其中當KCl濃度為0.005 mol/L時，油滴直徑小且分布均勻；當KCl濃度增加至0.05 mol/L時，乳液發生嚴重的油水分離現象，并且出現直徑超過20 μm的油滴；繼續增加KCl濃度至0.1 mol/L，體系油水分離的現象加劇，并且大量出現直徑超過30 μm的油滴，這說明油滴之間發生了聚結。上述現象表明增加體系離子強度，會導致納米淀粉酯表面電荷下降（圖3），致使納米淀粉酯無法吸附在油水界面上，降低了油滴之間的靜電斥力而導致油滴發生絮凝現象，并使Pickering乳液失去穩定性。Ettoumi等[29]研究發現由扁豆蛋白顆粒穩定的Pickering乳液體系對離子強度的變化十分敏感，當KCl濃度為50 mmol/L時，即會引發分散相與連續相的分離。此外，本研究發現增加離子強度會造成油滴表面電荷下降甚至會屏蔽油滴表面電荷，進而導致分散相油滴聚結而上浮，說明離子強度對Pickering乳液穩定性具有重要的影響[30]。

3 結 論

以醇沉和酯化相結合的方法制備納米淀粉酯，這種顆粒安全、有效，可以直接應用于制備食品級Pickering乳液。通過調節納米淀粉酯添加量，可以得到不同穩定性的水包油型Pickering乳液；當納米淀粉酯添加量為2.0 g/100 mL時，能夠制備出具有較強穩定性的Pickering乳液。

納米淀粉酯的電位受體系pH值和離子強度的影響。在溶液體系中，納米淀粉酯表面帶負電，并且隨pH值以及離子強度的改變而發生改變。在pH 3.0升高至pH 9.0過程中，納米淀粉酯所帶負電荷數呈明顯增加趨勢；在KCl濃度由0 mol/L增加至0.2 mol/L過程中，納米淀粉酯所帶負電荷數呈明顯下降趨勢；在低pH值或高離子強度條件下，納米淀粉酯所帶負電荷最少。

Pickering乳液的穩定性受體系納米淀粉酯含量、pH值和離子強度的影響。在乳液體系中，納米淀粉酯含量由0.5 g/100 mL增加至2.0 g/100 mL，分散相油滴的直徑呈顯著下降趨勢；利用熒光顯微鏡對Pickering乳液微觀結構進行觀察，納米淀粉酯在分散相油滴的表面形成一道致密的物理屏障，抑制油滴的聚結；在體系pH 5.0升高至pH 8.0過程中，分散相油滴的直徑呈現先減小后增大的趨勢，其中在pH 6.0下，Pickering乳液分散相油滴的直徑最??；在乳液體系KCl濃度由0.005 mol/L增加至0.1 mol/L過程中，分散相油滴的直徑明顯增加，其中當KCl濃度0.005 mol/L時，Pickering乳液中分散相油滴的直徑最小。