功能性發酵劑對發酵香腸氧化穩定性及揮發性風味物質的影響

曹辰辰，馮美琴，孫 健,*，徐幸蓮，周光宏

（1.南京農業大學食品科技學院，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2.金陵科技學院動物科學與技術學院，江蘇 南京 210038）

發酵香腸因其良好的口感和獨特的風味而受到消費者的喜愛，其中脂肪和蛋白質是發酵香腸中重要的組成部分，直接影響香腸的感官特性。在發酵過程中，脂肪的適度氧化會產生小分子揮發性化合物，對于醛類、烴類、醇類、酸類及酮類等揮發性風味成分的產生有重要作用，可改善肉制品的風味[1-2]。而脂肪的過度氧化會導致香腸風味變差、失去較好的質構特性和色澤，降低保藏期限，帶來安全隱患，從而影響消費者的接受程度。發酵香腸在加工過程中受到許多因素的影響而加劇脂肪氧化，如脂肪含量、肉的攪碎程度及攪碎時間、pH值、氯化鈉相對含量等[3]。蛋白質降解也是發酵肉制品加工過程中重要的化學變化，蛋白質適度的降解可以產生一些小肽和氨基酸等物質，提升產品的風味和營養價值，但蛋白質的過度氧化會對發酵肉制品的風味、色澤、質地、保水性、消化性等產生不利影響[4]。因此在發酵香腸的加工過程中，采用適當的方法抑制脂肪和蛋白質過度氧化具有重要意義。

目前，不少企業為延長發酵肉制品貨架期在其中加入人工抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯和特丁基對苯二酚等。人工合成抗氧化劑雖然在一定程度上能抑制氧化，卻存在食品安全風險[5]。據報道，人工合成抗氧化劑存在不安全因素，甚至可能具有毒性[6]。據Halliwell等[7]報道，二丁基羥基甲苯能夠抑制人呼吸酶的活性，攝入過多會引發癌癥和畸形等病癥。隨著發酵食品消費量的增加，越來越多的研究集中在開發新的益生菌，以增強產品感官特性和健康益處。乳酸菌在發酵肉制品中發揮重要的作用[8]。在發酵肉制品中，乳酸菌有助于形成低分子質量化合物，如肽[9]。肽不僅有助于發酵產品中特有風味的形成，還具有不同的生物活性，如抗氧化、抗高血壓和降膽固醇[10]。而葡萄球菌具有良好的蛋白酶和脂肪酶活性，對產品風味的形成起很大的促進作用。據Gallego[11]和Xing Lujuan[12]等報道，微生物有利于發酵肉制品產生肽，從中提取的肽具有良好的抗氧化活性，可以作為食品系統中合成抗氧化劑的替代物，具有安全高效的特點，從而避免了使用合成抗氧化劑的風險。帥瑾[13]報道了接種混合發酵劑能夠有效抑制香腸在發酵成熟中的過度氧化。此外，乳酸菌自身的抗氧化性已經得到許多學者的證實，Li Shengyu等[14]報道從中國傳統香腸中分離出的植物乳桿菌C88具有良好的羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性；Das等[15]報道了植物乳桿菌DM5具有較強的羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基清除活性；Han等[16]報道了從哈爾濱干香腸中分離的彎曲乳桿菌R5和發酵乳桿菌R6具有良好的抑制脂肪過氧化的能力；所以乳酸菌可以作為一種食源性抗氧化劑進行應用。因此，本實驗將篩選出的具有良好加工特性和益生特性的乳酸菌和符合發酵劑標準且經過較為全面的安全風險評估（包含血漿凝固酶、溶血、耐熱核酸酶、生物膜、藥敏、毒力基因等測定及動物毒理實驗驗證）的葡萄球菌作為發酵劑，接種發酵香腸，以自然發酵和商業發酵劑為對照，探究功能性發酵劑對發酵香腸抗氧化效果及揮發性風味物質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum CD101，NCBI編號為MG798695）、模仿葡萄球菌（Staphylococcus simulans NJ201，NCBI編號為MG798671）由本實驗分離鑒定所得。

1.1.2 香腸原輔料

豬瘦肉、豬背膘、豬腸衣 江蘇省蘇食肉品有限公司南京分公司；葡萄糖 南通奧凱生物技術開發有限公司；亞硝酸鈉 杭州龍山化工有限公司；異抗壞血酸鈉 鄭州拓洋實業有限公司；鹽、蔗糖、姜粉、五香粉、白胡椒粉 市售。

1.1.3 試劑

蛋白質羰基試劑盒 北京索萊寶生物有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 南京杰汶達生物科技有限公司；三氯乙酸、氯仿、碘化鉀、乙二胺四乙酸二鈉、異丙醇、石油醚、氫氧化鉀、2-硫代巴比妥酸等 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TC 12E絞肉機 意大利Sirman公司；VF608灌腸機德國Handtmann公司；KBF 240恒溫恒濕箱 德國Binder公司；FE20 pH計 美國Mettler Toledo公司；HVE-50自動高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；SPX-250B-Z生化培養箱 上海博訊實業有限公司；Ultra Turrax T25高速勻漿機 德國IKA公司；Spectral Max M2e多功能酶標儀美國伯騰儀器有限公司；SIM-F-124制冰機 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵劑的活化與制備

將L. plantarum CD101和S. simulans NJ201分別在液體MRS和MSA培養基中37 ℃孵育24 h，活化3 次后，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌3 次后重懸，菌懸液保留備用。

1.3.2 發酵香腸的制作

基本配方：新鮮豬瘦肉與豬背膘（質量比8∶2），其他成分以肉質量為基礎，添加量為食鹽2%、蔗糖1%、葡萄糖1%、亞硝酸鈉0.015%、異抗壞血酸鈉0.05%、姜粉0.1%、白胡椒粉0.1%、五香粉0.1%，發酵劑濃度為107CFU/g。

在研究三中，通過問卷調研我們發現，溝通越是靠近同步的程度，消費者就越能獲得更強的心流體驗。與此同時，研究三還對研究模型進行了整體檢驗。由于每個人對同步和異步的感知不同，所謂溝通的同步性也并不是保證信息的交流必須精準定位到同一個時間點。通過此研究，我們得出的結果是，溝通越是接近于同步性，也就是其他用戶回復速度越快，用戶的體驗感越強。溝通是一個循環往復的交互過程，而交互則意味著反饋的重要性。即時的反饋能帶來更強的融入感，也就可能進行更多的分享和交換，使得消費者在各個心理機制中表現出顯著的高水平。

工藝流程：原料肉的選擇→漂洗→絞肉→低溫腌制→攪拌→灌腸→恒溫發酵→干燥成熟。

在30 ℃、相對濕度80%的條件下發酵24 h后，移入15 ℃、相對濕度75%以減緩發酵，最后12 ℃、相對濕度72%干燥成熟得到成品。根據不同的實驗組添加發酵劑，分為3 組：1）對照組，不添加任何發酵劑，自然發酵，簡稱CK組；2）商業發酵劑組，添加發酵劑Lyocarni VBM-60進行發酵，簡稱CM組；3）實驗組：采用107CFU/g接種量按照1∶1接種L. plantarum CD101和S. simulans NJ201進行發酵，簡稱LC組。分別于香腸的加工及貯藏過程中的0、1（發酵結束）、5、9（成熟）、14、21（成品）、35 d（貯藏2 周）抽取樣品進行測定。

1.3.3 過氧化值（peroxide value，POV）的測定

按照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》[17]的方法進行測定。

1.3.4 硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric reactive substances，TBARS）值的測定

參照李鳴等[18]的方法并稍作修改，取4 g絞碎肉樣，加20 mL 7.5%的三氯乙酸（含0.1% EDTA-Na2），冰浴勻漿15 s兩次，調平后12 000×g離心5 min。取2 mL上清液，加入2 mL 0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸溶液，90 ℃水浴40 min，取出流動水冷卻后，1 000×g離心5 min，上清液中加2 mL氯仿搖勻，靜置分層后取上清液在532 nm波長處測定吸光度。用四乙氧基丙烷作標準曲線，TBARS值以肉樣中丙二醛含量計，單位mg/kg。

1.3.5 羰基值的測定

使用索萊寶蛋白質羰基試劑盒測定，方法參照說明書，用蛋白質中羰基含量（nmol/mg）表示。

1.3.6 巰基值的測定

參照Zakrys-Waliwander等[19]的方法稍作修改。取3 g剔除脂肪和筋膜的香腸樣品，加入5 ml 0.2mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.4），于8 000 r/min冰浴勻漿2 次，每次15 s。取0.5 mL勻漿液于試管中，加入5 mL 50 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，加入2.5 mL 10 mmol/L的DTNB（溶于0.1 mol/L，pH 8.0的Tris緩沖液）。反應液在25 ℃孵育30 min，于1 000×g離心5 min，測定上清液在412 nm波長處的吸光度。摩爾消光系數為13 600 L/（mol·cm），用于計算蛋白質中巰基含量，結果表示為nmol/mg。

1.3.7 揮發性風味物質的測定

采用固相微萃取法進行樣品處理。取5 g樣品置于20 mL頂空瓶中壓蓋，將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于60 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數據。

色譜條件：使用TR-5 MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），以氦氣為載氣，流速1 mL/min。升溫程序：爐溫在40 ℃保持3 min，以5 ℃/min的升溫速率升至90 ℃，不保持，再以10 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持6 min。

質譜條件：離子源溫度200 ℃，電離方式為電子電離，電子能量70 eV，發射電流120 μA，掃描質量范圍m/z 30～550。根據峰面積歸一法計算每種風味化合物的相對百分含量。

1.4 數據處理

本實驗每個處理設置5 個重復，數據采用SAS 9.1軟件中的Duncan新復極差法進行顯著性分析：P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。采用Factorial ANOVA進行方差分析，使用Origin 7.0繪圖軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對發酵香腸POV的影響

圖1 不同處理對發酵香腸POV的影響Fig. 1 Effect of different starter cultures on POV of fermented sausages

POV是評價脂肪氧化的初期產物氫過氧化物含量的指標，氫過氧化物極不穩定，很快再氧化反應生成酸、醛和酮等[20]。香腸在加工和貯藏過程中，脂肪容易在脂肪內源酶的作用下發生大量降解，其中含有雙鍵的不飽和脂肪酸由于其性質很不穩定，容易被氧化成氫過氧化物，使得香腸的POV急劇增加[21]。如圖1所示，在香腸的成熟過程中，不同處理組的POV總體呈現上升趨勢，表明3組香腸的脂肪氧化程度隨著時間的延長而不斷加深，這與李靜等[20]的研究結果類似。據報道[22]，在脂肪自動氧化的初期，過氧化物的生成速率大于其分解速率，使得過氧化物積累，進而導致POV逐漸升高。通過分析發現POV隨時間因素變化極顯著（P＜0.01），不同處理對POV的影響極顯著（P＜0.01），同時二者交互作用也極顯著（P＜0.01）。在發酵初期，3 組香腸的POV都較低，到第5天時CK組的POV大幅增加，這可能是CK組中氫過氧化物的形成速率快于分解速率導致。從第5天開始，LC組的POV顯著低于CK和CM組（P＜0.05），至第35天時CK、LC、CM組的POV分別達到41.83、17.40、27.54 mg/100 g。表明接種發酵劑在一定程度上抑制了香腸脂肪的氧化，且LC組的抗氧化效果優于CM組。

2.2 不同處理對發酵香腸TBARS值的影響

圖2 不同處理對發酵香腸TBARS值的影響Fig. 2 Effect of different starter cultures on TBARS value of fermented sausages

TBARS值是評價脂肪氧化程度的重要指標，主要反映了脂肪二級氧化產物丙二醛的含量[23]。如圖2所示，TBARS值隨時間因素變化極顯著（P＜0.01），不同處理對TBARS值影響極顯著（P＜0.01），二者的交互作用極顯著（P＜0.01）。結果表明，3 組香腸的TBARS值都呈上升趨勢，這與姜蕾等[24]的研究結果一致。因為隨著脂肪氧化程度的加深，次級產物逐漸增多，因此TBARS值也不斷增大。從第9天開始，LC組的TBARS值顯著低于CM和CK組（P＜0.05），且LC與CM組的TBARS值增加趨勢減緩，至第35天時CK、LC、CM組的TBARS值分別達到3.58、1.35、1.58 mg/kg。表明接種發酵劑在一定程度上抑制了丙二醛的產生，且LC組的抗氧化效果優于CM組。

本研究結果表明添加功能性發酵劑對香腸的POV和TBARS值均有抑制作用，且LC組的抗氧化效果優于CM組，該結果與帥瑾[13]和黃露[25]的研究結果一致。此外，Ruiz-Moyano等[26]報道了使用乳酸片球菌SP979接種發酵伊比利亞香腸使得其TBARS值顯著低于自然發酵組香腸。據Mejri等[27]報道，使用L. plantarum和L. pentosus等接種發酵香腸有助于產生抗氧化肽，呈現良好的抗氧化活性。此外，部分學者[14-15]還報道了乳酸菌對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基等具有良好的清除活性。因此，LC組的抗氧化效果可能與選取具有蛋白酶活性較強的發酵劑接種發酵有關，使得蛋白質在內源酶和微生物蛋白酶共同的作用下產生抗氧化肽，而抗氧化肽對自由基具有清除作用，從而阻斷了鏈式反應，替代自由基與不飽和脂肪酸結合，最終抑制脂肪氧化。同時，可能還與乳酸菌自身的抗氧化作用有關，具有一定的自由基清除能力。

2.3 不同處理對發酵香腸羰基值的影響

蛋白質氧化會導致氨基酸側鏈及肽鍵的斷裂，從而形成羰基，同時可以與二硫鍵作用使蛋白質交聯，從而導致蛋白質功能特性的下降[28]。不同處理組香腸的羰基值變化如圖3所示，羰基值受時間和處理因素的影響均為極顯著（P＜0.01），且時間與處理的交互作用極顯著（P＜0.01），隨著時間的延長，3 組香腸中羰基值都逐漸增大，表明蛋白質氧化程度不斷加深，該結果與前人的研究結果一致[29]。結果表明，0～5 d時3 組香腸的羰基值差異均不顯著（P＞0.05），且上升緩慢，從第9天開始羰基值顯著上升，LC與CM組顯著低于CK組（P＜0.05），但其二者之間差異不顯著。至第35天時，LC組與CM組的羰基值差異不顯著（P＞0.05），分別達到3.84 nmol/mg和4.27 nmol/mg，但顯著低于CK組的5.88 nmol/mg（P＜0.05）。表明接種發酵劑在一定程度上抑制了羰基的產生，但LC與CM組的處理對蛋白氧化的抑制效果相當。

圖3 不同處理對發酵香腸羰基值的影響Fig. 3 Effect of different starter cultures on protein carbonyl content of fermented sausages

2.4 不同處理對發酵香腸巰基值的影響

圖4 不同處理對發酵香腸巰基值的影響Fig. 4 Effect of different starter cultures on protein sulfhydryl content of fermented sausages

蛋白質表面的半胱氨酸殘基的氧化會導致巰基被氧化成二硫鍵、磺酸、次磺酸等，巰基值越低證明蛋白質氧化程度越大[24]，因此巰基值可以表示蛋白氧化的程度。如圖4所示，巰基值受時間和處理因素的影響均極顯著（P＜0.01），且時間與處理的交互作用極顯著（P＜0.01）。隨著時間的延長，不同處理組的香腸巰基值均呈現下降趨勢。發酵第1天時3 組香腸的巰基值顯著下降（P＜0.05），但0～5 d時3 組香腸之間的巰基值差異均不顯著（P＞0.05），表明此階段不同處理對巰基值無影響。在9～21 d階段，LC組與CM組的總巰基值差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于CK組（P＜0.05），表明LC與CM兩組的處理對蛋白質巰基氧化的抑制效果相當，這與羰基測定的結果一致。而在第35天時，LC組的巰基值達到32.86 nmol/mg，顯著高于CM組的29.32 nmol/mg和CK組的18.56 nmol/mg（P＜0.05），表明添加功能性發酵劑能有效抑制蛋白的氧化。此外祝超智[3]報道了在廣式臘腸的加工過程中加入不同濃度的粗肽液對蛋白質氧化有良好的抑制效果。

2.5 不同處理對發酵香腸揮發性風味物質的影響

表1 不同處理組揮發性風味物質的比較Table 1 Comparison of volatile flavor compounds of fermented sausages with different starter cultures

表2 不同處理組風味物質相對含量Table 2 Relative contents of flavor compounds in fermented sausages with different starter cultures%

續表2 %

續表2 %

如表1和表2所示，不同處理組發酵香腸共測出134 種揮發性化合物，其中包括醛類18 種，醇類24 種，酸類10 種，酯類25 種，酮類10 種，碳氫化合物41 種，其他類6 種。LC組檢測出的揮發性風味物質種類最多，共檢測出105 種風味物質，而CK和CM組分別檢測出91 種和93 種風味物質。3 組香腸中，醛類物質的比重最大，其中CK組達到28.88%，顯著高于LC與CM組（P＜0.05），這表明香腸中主要的風味物質是醛類，而LC組檢測出16 種醛類物質，種類數高于CK和CM組。由表2知，在醛類物質中，占比重最大的是己醛，這與先前研究結果一致[30]。其次多的為醇類，LC組達到21.63%，顯著高于CK和CM組（P＜0.05）。此外，酸類、酯類和碳氫化合物等相對含量也都在10%以上，而酮類和其他類相對含量較少，其中LC組的酯類和酮類的相對含量顯著高于其余兩組（P＜0.05），但3 組香腸的揮發性風味物質總相對含量差異不顯著（P＞0.05）。

醛類物質的閾值較低，主要來源于油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸的氧化以及氨基酸降解，是發酵香腸中最重要的風味化合物[31]，其中己醛是含量最高最主要的醛類，能夠反應脂肪的氧化程度[30]。本實驗結果表明CK組的醛類相對含量顯著高于其余2組，表明該組香腸的脂肪氧化程度最大，而LC組的相對含量顯著低于CM組，表明其抗氧化效果優于CM組發酵劑，這與前面的脂肪氧化實驗結果一致。另外，LC組的庚醛、辛醛和苯甲醛等相對含量顯著高于CM組，同時新檢出了癸醛、戊醛等對照組中沒有的風味物質，表明接種發酵劑能夠明顯改善香腸的風味，LC組的發酵劑效果優于CM組。據報道[32]，戊醛、庚醛、辛醛和癸醛分別具有脂香、奶香、鮮草香和甜香味，而苯甲醛具有苦杏仁味，微量的苯甲酸能夠帶給發酵肉制品特別的風味。

發酵香腸中的醇類物質主要通過微生物對糖類的代謝產生，如乙醇和2,3-丁二醇等；部分醇類通過脂肪氧化產生，如1-辛烯-3-醇；該物質具有蘑菇香氣并且閾值較低，具有一定代表性，因此對發酵香腸的風味形成有一定的作用[33]。本研究表明，在醇類中相對含量最大的是乙醇，其次是2,3-丁二醇，且LC組顯著高于其余2組，這與之前的研究一致[32]。可能是因為LC組的乳酸菌代謝碳水化合物的能力較強，導致LC組的醇類相對含量較高。此外，本研究中LC組的1-辛烯-3-醇的相對含量顯著高于其余2組，這也表明接種該組發酵劑有助于改善香腸的整體風味。

在發酵肉制品中，酸類物質較為重要且富有代表性，同時對生成酯類物質有貢獻作用[30]。可以發現3 個處理組中含量最高的均為乙酸，其中LC和CM組顯著高于CK組，這是因為乙酸主要通過微生物代謝碳水化合物產生，而LC與CM組中有大量乳酸菌，發酵產酸能力較強；另外脂肪與氨基酸代謝也會產生乙酸[33]。而LC組的乙酸含量低于CM組，可能是因為乙酸和乙醇發生酯化，生成乙酸乙酯。另外，丁酸也是一種重要的風味物質，LC組的丁酸含量顯著高于其余兩組，表明接種該組發酵劑對香腸的風味形成有一定貢獻。

據報道[34]，酯類物質是由醇和酸經過酯化反應生成的，多帶有芳香味，其中短鏈酸形成的酯類多呈水果香，長鏈酸形成的酯多呈較淡的油脂味，因此酯類對發酵香腸典型的風味形成有一定作用。LC組的乙酸乙酯和乳酸乙酯的相對含量均顯著高于CK與CM組，表明該組發酵劑對香腸風味的形成有一定貢獻，這可能因為LC組的醇類和酸類的相對含量較高，因此發生酯化反應后生成的酯類相對含量大。而酮類、碳氫化合物等閾值較高，對香腸特征風味的形成影響不大，因此對香氣的貢獻可以忽略。但是值得注意的是，LC組的3-羥基-2-丁酮相對含量較高，而該物質具有黃油味和干酪味，對香腸的風味有重要貢獻[30]。

3 結 論

本實驗使用功能性發酵劑混合發酵香腸，以添加商業發酵劑和自然發酵作為對照，通過POV、TBARS值、羰基值、巰基值和揮發性風味物質含量等結果探究功能性發酵劑對發酵香腸抗氧化及揮發性風味物質的影響。結果表明，接種功能性發酵劑L. plantarum CD101和S. simulans NJ201制作發酵香腸在一定程度上能夠抑制產品的脂肪氧化和蛋白氧化，其中抑制脂肪氧化的能力明顯優于商業發酵劑，而在蛋白氧化的抑制方面與商業發酵劑效果相當。同時，接種功能性發酵劑能夠顯著增加香腸的揮發性風味物質種類，提升產品的營養價值，改善風味，并且其效果優于商業發酵劑組。