融合型原肌球蛋白MBP-CTB-TM 構(gòu)建及其口服致敏性評價

傅玲琳，黃健健，謝夢華，王 翀，王彥波*

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江食品質(zhì)量安全工程研究院，浙江 杭州 310018）

近幾年來，食物過敏現(xiàn)象頻發(fā)，有研究表明，過敏人群在逐漸增加，全球大約有8%的兒童和4%的成人有過敏癥狀，研究認為這與抗生素等藥物使用以及環(huán)境等因素有關(guān)[1]。食物過敏是一種對食物蛋白質(zhì)（即過敏原）產(chǎn)生的不良反應(yīng)，主要有3 種介導(dǎo)方式，分為由免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)、非IgE介導(dǎo)以及IgE和非IgE混合介導(dǎo)，其中以IgE介導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)最為嚴重，其在短時間內(nèi)會引發(fā)各類癥狀[2]。在食物過敏發(fā)生的過程中，T細胞十分重要，初始CD4＋T淋巴細胞受抗原刺激后能夠分化成Th1、Th2、Th9和Th17等幾種細胞亞型，分化的細胞類型受抗原類型、抗原遞呈細胞表以及細胞因子等共同作用，從而調(diào)節(jié)免疫過程[3]。Th17型細胞主要參與機體的自身免疫疾病與炎癥的發(fā)生，其分泌的細胞因子IL-17A能誘導(dǎo)IL-6等炎癥細胞因子聚集在炎癥部位，從而導(dǎo)致組織破壞[4-5]。

目前，小鼠、大鼠、豚鼠、犬和幼豬等多種動物都被用于食物過敏實驗研究，其中小鼠應(yīng)用最廣泛。常用的動物模型有腹腔注射過敏原模型與經(jīng)口灌胃過敏原模型，后者能更好地反映生理狀況，研究結(jié)果更加可靠。但由于口服食物蛋白易使機體產(chǎn)生耐受[6]，故一般需要利用大劑量過敏原及黏膜佐劑。因此，部分研究者嘗試采用原核表達過敏原代替天然蛋白用于食物過敏相關(guān)研究[7-10]。但在構(gòu)建經(jīng)口致敏模型時仍需要大量過敏原刺激且仍需依賴黏膜佐劑，因此并未解決根本問題。早期研究發(fā)現(xiàn)將黏膜佐劑與抗原進行化學偶聯(lián)能夠增強抗原的免疫原性[11-13]，進一步將黏膜佐劑與抗原共同原核表達，也能夠增強抗原的免疫原性，降低抗原使用劑量[14-15]。然而關(guān)于將黏膜佐劑與食物過敏原蛋白重組從而應(yīng)用于構(gòu)建動物致敏模型的研究卻鮮有報道。因此，本研究擬通過原核重組表達技術(shù)，將黏膜佐劑與過敏原形成融合蛋白，應(yīng)用于食物過敏動物模型的構(gòu)建，并探索其優(yōu)越性。

霍亂毒素（cholera toxin，CT）是口服致敏模型中最常使用的黏膜佐劑，能夠增強小鼠Th2型免疫應(yīng)答。CT是由霍亂弧菌所產(chǎn)生的毒素，由1 個A亞基（CTA）和5 個B亞基（CTB）組成AB5形式[14]，其中CTB以五聚體形式存在，通過與腸上皮細胞表面GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合而進入體內(nèi)[16]。由于CT的毒性，導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制且中國海關(guān)限制進口，開發(fā)更安全的CT替代品將會大幅促進食物過敏研究。已有研究表明CT的兩個亞基均能增強黏膜免疫，可單獨作為黏膜佐劑使用，其中CTB由于無毒而應(yīng)用性更為廣泛[17-18]。例如在原核表達黏膜佐劑時，鑒于CT結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及毒性，常選擇單獨表達無毒的CTB作為黏膜佐劑。但由于CTB的聚集性，單獨表達CTB易形成包涵體而大大降低產(chǎn)量，故而有學者通過CTB與大腸桿菌周質(zhì)中的分子伴侶——SKP蛋白共表達，促進CTB在原核表達時的溶解性[19]。

鑒于此，本研究采用原核表達中常用的促溶蛋白——麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose-binding protein，MBP）[20-21]促進CTB的可溶性表達。利用E. coliStbl3工程菌進行分子克隆能有效降低錯誤重組，E. coliBL21菌株進行蛋白表達能夠有效避免目的蛋白的降解。進一步用高效轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞系對融合蛋白的表達以及跨膜能力進行驗證。基于此，本研究利用同源重組，將MBP、CTB以及增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）重組為融合蛋白MBP-CTB-EGFP，熒光探究MBP-CTB-EGFP能否跨越細胞膜，從而具有作為黏膜佐劑的潛力。此外用水產(chǎn)品中主要過敏原原肌球蛋白（tropomyosin，TM）構(gòu)建MBP-CTB-TM，并將其從大腸桿菌原核表達獲得的融合蛋白應(yīng)用于動物致敏實驗，探究融合蛋白的致敏性及其對小鼠食物過敏相關(guān)免疫反應(yīng)的影響，探索其是否能降低過敏原使用劑量，從而替代天然蛋白進行TM相關(guān)的食物過敏研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

南美白對蝦購買于杭州蕭山養(yǎng)殖場；SPF級Balb/c小鼠采購并飼養(yǎng)于杭州師范大學實驗動物中心，雌性，6～8 周齡，體質(zhì)量為（20±2）g，共80 只，隨機分組，每組10 只。

E. coliStbl3、E. coliBL21、HEK293T細胞均為本實驗室保存菌株或細胞；pEX-4T-1-malE-egfp-10His、pEX-4T-1-malE-tm-10His均由本實驗保存或構(gòu)建，攜帶N-端malE促溶標簽和10×His親和純化標簽，malE、egfp和tm基因分別表達MBP、EGFP和TM蛋白，其中，tm基因由課題組前期研究根據(jù)南美白對蝦基因組序列人工合成，并通過常規(guī)分子克隆替換pEX-4T-1-malE-egfp-10His中的egfp片段獲得[22]；pUC57-ctxB質(zhì)粒由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成，其中，ctxB為CTB蛋白的基因；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）涉及的所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.2 試劑

FastDigestNotI 美國Thermo Scientific公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、質(zhì)粒提取試劑盒、Ni-NTA親和柱、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）相關(guān)用品 生工生物工程（上海）股份有限公司；高保真PCR試劑盒（Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase）、同源重組試劑盒（Clon Express?II One Step Cloning Kit） 南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；50×TAE緩沖液 北京諾博萊德科技有限公司；喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Goat Anti-Mouse IgG1-HRP、Goat Anti-Mouse IgG2a-HRP、Goat Anti-Mouse IgE-HRP 美國Southern Biotech公司；3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）美國eBioscience公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國BD公司；胎牛血清FBS 美國Gbico公司；聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI） 美國Polysciences公司；Bio-Plex ProTM小鼠細胞因子試劑盒 美國Bio-Rad公司；其他普通化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini protein III垂直板電泳儀 美國Bio-Rad公司；Alpha化學發(fā)光凝膠成像儀（配有ALPHAVIEW SA電泳圖像分析軟件） 美國Proteinsimple公司；VersaMax型酶標儀 美國Molecular Devices公司；臺式冷凍高速離心機 美國Beckman Coulter公司；MLS-3750全自動高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司；瓊脂糖電泳儀 中國北京六一艾科儀器公司；普通PCR儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 MBP-CTB-EGFP及MBP-CTB-EGFP融合蛋白的原核重組表達

1.3.1.1 高保真PCR擴增目的基因ctxB序列（含目的質(zhì)粒NotI酶切位點同源序列）

根據(jù)高保真PCR試劑盒擴增pUC57-ctxB質(zhì)粒中的ctxB序列（含目的質(zhì)粒插入點同源序列）。反應(yīng)體系：25 μL 2×Phanta Max Buffer（含Mg2＋），1 μL dNTP Mix（10 mmol/L each），1 μL（約10 ng）模板DNA，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U/μL），18 μL ddH2O。上游引物：5’-ACAAGGACGACGATGACAAG-3’；下游引物：5’-TCCATTGCGCCGGCGCCTGC-3’。PCR程序：95 ℃、30 s預(yù)變性；95 ℃、15 s變性，61 ℃、15 s退火，72 ℃、45 s延伸，30 個循環(huán)；72 ℃、5 min。取部分擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖電泳以檢驗擴增效果。

1.3.1.2 目的載體質(zhì)粒線性化

根據(jù)FastDigestNotI試劑盒說明書配制反應(yīng)體系：15 μL無核酸酶水，2 μL 10×FastDigest Buffer，2 μL（約1 μg）質(zhì)粒DNA，1 μL FastDigestNotI。反應(yīng)管放置到PCR儀中，37 ℃孵育30 min使環(huán)狀質(zhì)粒充分線性化，之后80 ℃加熱5 min使酶失活。

1.3.1.3 PCR擴增產(chǎn)物和目的載體的同源重組

根據(jù)同源重組試劑盒說明書設(shè)計及配制反應(yīng)體系：4 μL 5×CE II Buffer，3 μL線性化克隆載體，1 μLctxB擴增產(chǎn)物（含目的質(zhì)粒插入點同源序列），2 μL Exnase?II，10 μL ddH2O。將反應(yīng)管置于PCR儀中，設(shè)置37 ℃、30 min，再永久4 ℃保存，取出前保證反應(yīng)液在4 ℃放置5 min以上。

同源重組反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板：取5 μL冷卻反應(yīng)液，加入到50 μLE. coliStbl3感受態(tài)細胞中，彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。42 ℃熱激45～55 s，冰水浴孵育2 min。加入1 mL LB培養(yǎng)基（無抗生素），37 ℃搖床孵育1 h，充分復(fù)蘇。取100 μL菌液均勻涂布LB瓊脂（含1‰ Amp）平板上。將平板倒置，于37 ℃培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)后，從平板上挑取分散良好的單菌落接種到5 mL的LB肉湯（含1‰ Amp），于37 ℃培養(yǎng)16 h，再進行菌液PCR鑒定。挑選PCR正確的菌液送擎科生物有限公司測序，并對測序結(jié)果進行比對，選擇最匹配的菌液按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His、pEX-4T-1-malE-ctxB-tm-10His并保存。

1.3.1.4 融合蛋白在E. coliBL21中的表達

將質(zhì)粒pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His及pEX-4T-1-malE-ctxB-tm-10His分別轉(zhuǎn)化到E. coliBL21菌液，并進行涂板，具體步驟同1.3.1.3節(jié)。挑取單菌落，轉(zhuǎn)移至5 mL的LB肉湯（含1‰ Amp）中，37 ℃搖床培養(yǎng)16 h，獲得原核表達工程菌。

按照工程菌液：新鮮LB肉湯（含1‰ Amp）為1∶100接入工程菌液，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.6～1.0（約3 h）。在超凈臺中加入IPTG（終濃度為0.1 mmol/L），立即放置于16 ℃或37 ℃（MBP-CTBEGFP為16 ℃，MBP-CTB-TM為37 ℃），200 r/min培養(yǎng)16～24 h。然后將菌液在室溫條件下4 000 r/min離心20 min，收集菌體，稱質(zhì)量。按照菌體濕質(zhì)量與酶解液（含0.2 mg/mL溶菌酶，20 μg/mL DNase，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L PMSF）1∶30的比例加入酶解液，吹打使菌體懸浮，然后置于4 ℃裂解30 min；在冰浴、超聲2 s-間歇5 s條件下，用超聲破碎機將裂解液超聲5 min，至液體顏色均一、無黏稠團聚物質(zhì)。20 000×g離心20 min，收集上清液。沉淀重新加入酶解液重懸后再次20 000×g離心20 min，收集上清液，合并兩次上清液，并用0.45 μm濾膜過濾。之后按照Ni-NTA親和柱試劑盒說明書采用離心法對融合蛋白進行純化，并將洗脫液置于PBS中透析24 h，中間更換3 次PBS。隨后進行SDS-PAGE：配制12%的分離膠與5%的濃縮膠，厚度為1.0 mm。將溶于PBS的TM取出少量，與4×蛋白質(zhì)SDSPAGE上樣緩沖液混勻，置于沸水浴中加熱5 min后取7 μL上樣。濃縮膠電壓120 V、10 min后，分離膠電壓180 V、40 min。

1.3.1.5 MBP-CTB-EGFP重組蛋白細胞膜穿透能力驗證

對照組將1 μg質(zhì)粒、3 μL PEI和100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基混合均勻，靜置30 min后，均勻加入細胞，作用5 h后用顯微鏡觀察。實驗組取對數(shù)生長期的HEK293T細胞用胰酶消化后加入新鮮培養(yǎng)基，以每孔0.5 mL接種于24 孔板，培養(yǎng)1 d后，直接加入過0.22 μm濾膜的目的蛋白，終濃度為4 μmol/L，作用5 h后，用無菌PBS洗滌3 次，直接用熒光顯微鏡觀察細胞。

1.3.2 Balb/c小鼠致敏模型

1.3.2.1 動物致敏實驗方案

將小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±3）℃、濕度（50±10）%的無菌飼養(yǎng)間，喂食小鼠基礎(chǔ)日糧。致敏處理開始前一周，按照標準實驗動物普通飲食飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)，小鼠自由進食飲水，每日下午更換飼料。CTB-TM致敏組每周連續(xù)3 d灌胃600 μg溶于200 μL PBS的MBP-CTBTM，連續(xù)3 周，使小鼠致敏。第5周采用更高劑量（1 500 μg）進行激發(fā)灌胃，1 周2 次，間隔4 d。PBS組每次灌胃與實驗組等體積的PBS，CTB組每次灌胃與實驗組等體積的含有CTB（250 μg）的PBS，TM組每次灌胃與實驗組等體積的含有TM的PBS，免疫方案如圖1所示。第2次激發(fā)后對小鼠采用內(nèi)眥靜脈叢采血，血液于37 ℃孵育1 h，再3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取血清于新的EP管中，-80 ℃保存。取血后將小鼠處死，浸泡于75%乙醇溶液中，并在無菌超凈工作臺內(nèi)解剖，取其脾臟。

圖1 小鼠免疫方案Fig. 1 Mouse immunization protocol

1.3.2.2 血清TM特異性抗體IgE、IgG2a、IgG1的測定

小鼠血清TM特異性抗體IgE、IgG2a、IgG1抗體反應(yīng)均采用雙抗體夾心間接ELISA法檢測。EIA/RIA 96 孔板包被100 μL含10 μg/mL從天然蝦中提取純化的TM（具體提取方法參考傅玲琳等[23]），4 ℃孵育過夜；用PBS＋0.05%吐溫20洗滌3 次后，加入200 μL封閉液，37 ℃孵育1 h；洗滌3 次后加入100 μL稀釋后小鼠血清樣品（IgE 1∶6，IgG2a 1∶200，IgG1 1∶200），37 ℃孵育2 h；洗滌5 次后加入100 μL辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗（羊抗鼠IgG1-HRP、羊抗鼠IgG2a-HRP、羊抗鼠IgE-HRP），37 ℃孵育1 h；洗滌5 次后加入100 μL TMB底物，37 ℃避光孵育20 min后加入50 μL終止液，在450 nm波長測定各孔的OD值。

1.3.2.3 脾臟共培養(yǎng)上清液細胞因子的測定

無菌條件下取出脾臟后置于200 目篩上，加入少量PBS，用無菌注射器輕輕研磨脾臟，使細胞過目篩，然后再加入少量PBS洗滌目篩，收集所有濾液于15 mL無菌離心管中，經(jīng)過紅細胞裂解，PBS洗滌2 次后，用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青霉素及鏈霉素雙抗）重懸細胞至106～107/mL。取1 mL加入12 孔板中，再加入已過0.22 μm濾膜的從蝦肉中提取的天然蛋白TM（終質(zhì)量濃度100 μg/mL），于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，然后離心收集細胞上清液。細胞因子采用Bio-Plex ProTM小鼠細胞因子試劑盒進行檢測，按照說明書進行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建質(zhì)粒pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His（圖2A），利用熒光探究MBP-CTB-EGFP是否能跨越細胞膜，從而具有作為黏膜佐劑的潛力。如圖2B所示，目的基因CTB片段克隆成功，條帶單一整齊，無雜條帶，效果較好。由圖2C可知，菌落PCR克隆成功，條帶位置單一，無雜條帶，位置在1 000～1 500 bp，靠近1 000 bp，與ctxB-egfp（約1 100 bp）的大小符合，表明pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His成功構(gòu)建。

圖2 質(zhì)粒pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His構(gòu)建Fig. 2 Construction of plasmid pEX-4T-1-malE-ctxB-egfp-10His

2.2 pEX-4T-1-malE-ctxB-tm-10His質(zhì)粒構(gòu)建

圖3 質(zhì)粒pEX-4T-1-malE-ctxB-tm-10His構(gòu)建Fig. 3 Construction of plasmid pEX-4T-1-malE-ctxB-tm-10His

利用同源重組，將MBP、CTB以及水產(chǎn)品中主要過敏原TM重組為融合蛋白MBP-CTB-TM（圖3A），并進行大腸桿菌原核表達獲得大量目的蛋白以為后續(xù)動物模型構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。由圖3B可知，目的基因ctxB片段成功克隆，條帶單一整齊，無雜條帶，效果較好。由圖3C可知，ctxB-tm片段菌落PCR克隆成功，條帶位置單一，無雜條帶，位置在1 000～1 500 bp，也與ctxB-tm（約1 200 bp）的大小符合。

2.3 重組蛋白MBP-CTB-EGFP及MBP-CTB-TM表達及純化

圖4 融合蛋白MBP-CTB-EGFP與MBP-CTB-TM在E. coli BL21中的表達及純化Fig. 4 Expression in E. coli BL21and purification of fusion proteins MBP-CTB-EGFP and MBP-CTB-TM

從南美白對蝦中純化天然TM作為對照，SDA-PAGE結(jié)果如圖4A所示。利用大腸桿菌重組表達融合蛋白，由圖4B可知，Ni-NTA純化后MBP-CTB-EGFP融合蛋白純度較高，雜蛋白較少，SDS-PAGE圖只在上樣量非常大時才顯示有雜條帶。由圖4C、D的Western bolt和SDSPAGE結(jié)果可知，MBP-CTB-TM融合蛋白可在E. coliBL21中大量表達，且Ni-NTA純化后可得高濃度且純度較高的融合蛋白MBP-CTB-TM。經(jīng)過蛋白含量測定，MBP-CTB-EGFP和MBP-CTB-TM在大腸桿菌的表達量在50～80 mg/L培養(yǎng)液。且原核表達獲得的融合蛋白較從蝦肉中提取天然蛋白TM的方法，實驗操作耗時短，毒性低，蛋白得率更高[24]。

2.4 MBP-CTB-EGFP重組蛋白細胞膜穿透能力驗證

將融合蛋白與細胞共同孵育，利用EGFP的熒光效果，使用熒光顯微鏡觀察融合蛋白MBP-CTB-EFGP能否進入細胞，因此驗證其是否具有作為黏膜佐劑的潛力。如圖5可知，MBP-CTB-EGFP融合蛋白確實可穿過HEK293T細胞的細胞膜進入到細胞內(nèi)，說明MBP-CTBEGFP在原核表達后仍具有作為黏膜佐劑的能力，從而促進外源蛋白進入細胞內(nèi)。此外，通過與MBP-CTB-EGFP基因利用轉(zhuǎn)染進入細胞相比，MBP-CTB-EGFP融合蛋白攜帶外源蛋白進入細胞的效率更高。

圖5 MBP-CTB-EGFP融合蛋白跨越細胞膜能力驗證Fig. 5 Verification of the ability of MBP-CTB-EGFP fusion protein to cross cell membrane

2.5 融合蛋白MBP-CTB-TM對小鼠血清中TM特異性抗體的影響

圖6 小鼠血清中TM特異性IgE（A）、IgG1（B）、IgG2a（C）含量變化Fig. 6 Levels of TM-specific IgE, IgG1 and IgG2a in serum samples of mouse model

食物過敏主要由IgE介導(dǎo)，致敏機體攝入過敏原后，過敏原會迅速與致敏肥大細胞或嗜堿性粒細胞表面的特異性IgE結(jié)合，使肥大細胞或嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯、IL-4等炎癥因子，從而產(chǎn)生過敏反應(yīng)組織特異性癥狀[25]。此外，大量研究表明，食物過敏的發(fā)生與體內(nèi)Th1/Th2細胞平衡偏向于Th2細胞反應(yīng)相關(guān)[26]，其中Th2型細胞因子促進IgG1、IgE的分泌，而Th1型細胞因子則促進IgG2a的分泌[27-28]。由圖6可知，融合蛋白MBP-CTB-TM免疫小鼠后，血清中均能檢測到高水平的TM特異性IgE、IgG1、IgG2a，初步表明融合蛋白MBP-CTB-TM確實可替代蛋白使小鼠產(chǎn)生TM特異性的抗體反應(yīng)。由圖6A可知，天然蛋白TM組與對照組IgE相比無明顯差異，但能誘導(dǎo)IgG產(chǎn)生，說明此劑量的蛋白引起口服免疫耐受而無法引起小鼠的過敏反應(yīng)，若引起過敏反應(yīng)需要更高劑量的TM。融合蛋白MBP-CTB-TM免疫小鼠，TM特異性IgE的相對含量（OD450nm）達到0.4，與實驗室前期用天然蛋白獲免疫小鼠后的0.05相比[22]增加近8 倍，表明融合蛋白MBP-CTB-TM致敏效果更好，有可能達到降低過敏原用量的效果。此外，由IgG1和IgG2a的相對含量（OD450nm）可知，雖然兩者融合蛋白MBP-CTB-TM組相對于對照組而言均顯著提高，但IgG1水平明顯高于IgG2a，表明融合蛋白提高整體炎癥水平并導(dǎo)致體內(nèi)Th1/Th2免疫反應(yīng)不平衡。而MBP-CTB-TM組與TM組性比IgG1相對含量（OD450nm）無較大差別，且MBP-CTB-TM組IgG2a略低于TM組，說明融合蛋白在致敏后的抗體反應(yīng)中偏向于Th2型反應(yīng)。

2.6 融合蛋白MBP-CTB-TM對小鼠脾臟細胞培養(yǎng)上清中細胞因子質(zhì)量濃度的影響

圖7 小鼠脾臟細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的質(zhì)量濃度Fig. 7 Cytokines concentrations in culture supernatant of spleen cells of two Balb/c mouse models

研究證實食物過敏的發(fā)生與體內(nèi)Th1/Th2細胞平衡偏向于Th2細胞反應(yīng)相關(guān)。也有研究表明，Th17型細胞反應(yīng)主要與自身免疫疾病有關(guān)，與食物過敏的發(fā)生也存在相關(guān)性，當食物過敏反應(yīng)發(fā)生時，機體會誘導(dǎo)產(chǎn)生強烈的Th17型免疫應(yīng)答并釋放大量IL-17、IL-6和IL-23等炎性細胞因子[29-30]。由2.5節(jié)IgE、IgG1、IgG2a水平變化，可以初步看出致敏小鼠體內(nèi)Th1/Th2免疫反應(yīng)偏向Th2，但是，由圖7可知，MBP-CTB-TM組中小鼠脾臟細胞培養(yǎng)上清中Th2型細胞因子IL-4、IL-5并沒有顯著上升且都低于TM組，而Th17型細胞因子IL-6、IL-17A顯著上升且都高于TM組，且IL-17A的質(zhì)量濃度比TM組顯著增加，說明融合蛋白MBP-CTB-TM比天然蛋白TM更易于促進Th17型反應(yīng)的發(fā)生，這表明融合蛋白MBP-CTB-TM雖可減低過敏原劑量且致敏小鼠，并使其產(chǎn)生TM特異性的抗體反應(yīng)，但其致敏機理可能與天然蛋白存在差異，將其代替天然蛋白應(yīng)用于食物過敏相關(guān)研究仍需謹慎，需根據(jù)實驗?zāi)康纳髦剡x擇。

3 結(jié) 論

近年來，隨著生活水平的提高，人們對甲殼類水產(chǎn)品例如蝦的消費也逐漸增加，相關(guān)食物過敏問題的報道逐漸增加[31-32]。但大多數(shù)相關(guān)研究利用從蝦中直接提取純化得到TM作為過敏原開展實驗，此過程實驗耗時長，蛋白得率低，結(jié)果不穩(wěn)定。本研究將MBP-CTB-EGFP、MBP-CTB-TM兩個重組蛋白在E. coli BL21中表達，重組蛋白表達量高，易于提取，不受季節(jié)影響，為后續(xù)采用重組蛋白構(gòu)建食物過敏動物模型的研究提供了實驗材料，有望減少抗原的使用量，縮短口服致敏模型構(gòu)建及機理研究的前期準備時間。然而值得注意的是，原核重組表達的融合蛋白與多數(shù)真核過敏原相比，其致敏機理可能存在差異，故重組蛋白是否具有黏膜佐劑和過敏蛋白的作用，并產(chǎn)生1＋1＞2的效果仍是未知，需進一步驗證。此外，本研究發(fā)現(xiàn)重組蛋白能導(dǎo)致Th17型細胞因子IL-6、IL-17A顯著上升，因此推測，其可能能夠作為研究Th17型疾病的有力工具。