腸膜明串珠菌ATCC 12291蔗糖磷酸化酶的酶學性質及轉糖苷分子改造

何賀賀，林厚民，寇力丹，覃鳳蘭，韋宇拓，黃日波，杜麗琴*

（亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530005）

蔗糖在植物體內廣泛存在，是人類生產生活中最重要的食品添加劑之一[1]。利用生物酶資源拓寬蔗糖的應用范圍，生產高附加值產品成為研究熱點方向之一。蔗糖磷酸化酶（EC 2.4.1.7）在碳水化合物活性酶數據庫屬于糖基水解酶13家族[2]。此酶能夠可逆催化蔗糖和無機磷酸生成D-果糖和葡萄糖-1-磷酸[3]，葡萄糖-1-磷酸是糖酵解途徑的重要中間體[4]，這使得蔗糖磷酸化酶在代謝中具有重要作用。蔗糖磷酸化酶除能水解蔗糖以外，還具有催化轉移葡萄糖苷鍵的能力[5]，并且受體較為廣泛，包括無機磷酸、水，及含有酚羥基、醇羥基及羧基的物質[6]。葡萄糖基具有極性強、結構穩定的特點，因此所生成的產物在理化性質如耐熱性、水溶性、抗氧化性等方面都普遍得到改善，使得該酶在食品、醫藥、及化妝品等行業具有較強的應用價值和潛力[7]。目前此酶研究最多的是催化轉糖苷反應，并且對其分子改造大多也是為了改善轉糖苷性質。其中糖類底物的轉糖苷產物益生元低聚糖，常被作為低熱量、非齲齒性的食品添加劑，也是目前研究熱點之一[8]。

蔗糖磷酸化酶主要存在于微生物體內，最早于20世紀40年代分別被Kagan[9]與Doudoroff[10]等從腸膜明串珠菌和嗜糖假單胞菌中發現。Schwarz等[11]通過對腸膜明串珠菌的蔗糖磷酸化酶進行突變改造，確定了196位點的天冬氨酸為其轉糖苷關鍵位點之一，揭開了探索該酶催化機理的序幕。Van Den Broek等[12]克隆表達了來自青春雙歧桿菌DSM 20083的蔗糖磷酸化酶，并研究轉糖苷性質，發現其對于單糖具有良好的轉糖苷特性，而二糖和三糖并不適合作為其底物。李恬等[13]以蔗糖作為葡萄糖的供體底物，麥芽四糖作為加成引物，利用蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶協同作用探索出了直鏈糊精的低成本且操作簡單的合成途徑，為工業化大規模生產提供了理論基礎。

為改善酶學性質，對蔗糖磷酸化酶的分子改造也取得了較多進展。Verhaeghe等[14]利用半理性突變的方法，構建突變體文庫并進行高通量篩選，得到了一個對曲二糖選擇性高達95%的雙位點突變體，為其在食品及益生元領域的應用提供了基礎。Kraus等[15]首次對于活性位點進行突變，間接性的增大活性口袋空間，使得該酶能對以多酚類的底物具有轉糖苷作用。其中對于槲皮素的糖基化能提高其抗氧化還原能力[16]，并且人體對于其吸收利用能力也得到增強[17]。

綜上，對于蔗糖磷酸化酶的研究必定是以大量酶學性質數據作為基礎和支撐的。本研究旨在豐富不同來源蔗糖磷酸化酶的數據，對蔗糖磷酸化酶進行改造，進一步挖掘潛在的結構和理論價值，得到更多有關于分子改造的經驗，為此酶分子改造技術的進步以及在食品行業的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroidesATCC12291、大腸桿菌Escherichia coliM15/pREP4、大腸桿菌E. coliXL10-Gold均為本實驗室保存。

高保真DNA聚合酶Prime STARTMHS、dNTP Mixture、λDNA/Hind III Marker、蛋白質Marker以及限制性內切酶EcoR I、Hind III、BamH I、T4DNA連接酶等大連TaKaRa寶生物工程有限公司；DpnI 富酶泰斯生物技術（深圳）有限公司；DNA純化試劑盒、膠回收試劑盒、質粒DNA小量提取試劑盒 BioFlux杭州博日科技有限公司；鎳親和層析填料Ni-NTA 德國Qiagen公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 美國Gibco公司；葡萄糖-1-磷酸 美國Sigma公司；色譜級乙腈 美國Fisher公司；葡萄糖、蔗糖等其他糖類試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Biometra聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國耶拿公司；SHEL LAB W20M-2水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；恒溫培養箱 上海予騰生物科技有限公司；恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；臺式離心機 德國艾本德公司；酶標儀 美國伯騰儀器公司；1260 infinity Series高效液相色譜分析儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 腸膜明串珠菌ATCC 12291蔗糖磷酸化酶基因的克隆

將腸膜明串珠菌ATCC 12291活化培養，采用機械破胞法提取基因組DNA。對已報道的腸膜明串珠菌ATCC 12291蔗糖磷酸化酶基因lmsp所編碼的氨基酸序列進行蛋白質結構和信號肽分析，然后設計擴增引物，引物為：LMsp-F：5’-CGCGGATCCGAAATTCAAAACA AAGCAATGTTG-3’，引入BamH I酶切位點；LMsp-R：5’-CCCAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTGAGT CAAATTATCACT-3’，引入Hind III酶切位點和組氨酸標簽。

PCR程序：98 ℃、2 min預變性，98 ℃、10 s變性，56.5 ℃、15 s退火，72 ℃、2 min延伸，30 個循環；72 ℃、10 min。將PCR產物和pQE30質粒分別進行BamH I和Hind III雙酶切處理，之后經連接并轉化至E.coliXL10-Gold中。經過測序，將成功構建的重組質粒命名為pQE-lmsp。

1.3.2 重組酶LMsp的誘導表達和蛋白質純化

將重組質粒轉入E. coliM15/pREP4中，于37 ℃培養至OD600nm約0.4～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，20 ℃、180 r/min培養22 h。離心并收集菌體，超聲波破碎后，對上清液進行Ni-NTI鎳親和層析，純化后得到重組酶命名為LMsp，并進行變性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

1.3.3 重組酶LMsp的酶學性質分析

利用3,5-二硝基水楊酸比色法測定酶學的基本參數[18]。反應體系設為200 μL。取180 μL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液、10 μL 20 g/100 mL蔗糖，在最適反應溫度溫浴2 min后，加入10 μL適當稀釋酶液，精確反應20 min后加入2 倍體積3,5-二硝基水楊酸（400 μL）終止反應，沸水浴5 min顯色。待樣品冷卻至室溫，取200 μL至96 孔酶標板中，在540 nm波長處讀取樣品的吸光度。

蔗糖磷酸化酶活力單位（U）的定義：在最適反應條件下，每1 min水解蔗糖釋放1 μmol還原糖所需的酶量。

1.3.3.1 最適pH值的測定

以pH 4.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制反應體系，加入適當稀釋純酶液在37 ℃條件下精確反應20 min，測定不同pH值條件下的酶活力。以最高活力為100%，計算不同pH值條件下酶的相對活力，相對活力最高的pH值即為酶最適反應pH值。

1.3.3.2 最適溫度的測定

在最適p H值條件下，測定在不同反應溫度（30～65 ℃）條件下的酶活力，以最高活力為100%計算不同溫度條件下酶的相對活力，相對活力最高的溫度即為酶最適反應溫度。

1.3.3.3 重組酶pH值穩定性的測定

將重組酶在不同pH值的緩沖液（4.0～8.0）中于4 ℃保存12 h，在最適反應條件下測定其殘存酶活力，以保存在pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉洗脫液中的酶活力為100%，計算不同pH值下重組酶的相對活力。

1.3.3.4 重組酶熱穩定性的測定

將重組酶保存在不同溫度（25～60 ℃）下1 h，立即取出放于冰上，在最適反應條件下測定殘存酶活力，以4 ℃保存的酶活力為100%，計算不同溫度下重組酶的相對活力。

1.3.3.5 重組酶Km和Vmax值的測定

在最適反應溫度和pH值條件下，測定以不同濃度（1.5～234 mmol/L）蔗糖為底物時的酶活力，帶入經典米氏方程得到酶的Km、Vmax值。

1.3.3.6 轉糖苷功能的測定

以15%葡萄糖-1-磷酸（溶于最適pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液）為葡萄糖基供體，5%的D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-木糖醇、D-半乳糖、D-甘露糖、D-甘露糖醇、D-果糖、D-葡萄糖、L-山梨糖、D-山梨糖醇、L-鼠李糖為受體，加入60 μg純化酶液配制成200 μL反應體系，在最適條件下反應12 h，沸水浴10 min終止反應，冷卻至室溫后，12 000 r/min離心30 min取上清液進行高效液相色譜分析，檢測其反應產物。轉化率定義為實驗組底物減少量與對照組底物量的比值。

色譜檢測條件：檢測器：示差折光檢測器（Agilent 1260 RID）、散射蒸發光檢測器（Allteach 2000ES ELSD）；色譜柱：Alltima Aminoz NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：72%乙腈；流速：1 mL/min；柱溫：室溫（26 ℃）；上樣量：20 μL。

1.3.4 LMsp的分子改造

采用半理性設計的方法尋找可能影響蔗糖磷酸化酶LMsp轉糖苷活性的關鍵氨基酸，并利用反向PCR技術進行定點突變改造。

使用建模軟件SWISS-MODEL對蔗糖磷酸化酶LMsp的氨基酸序列進行分析，以青春雙歧桿菌蔗糖磷酸化酶的3D結構（序列一致性＞36%）為模板，建立LMsp的蛋白質三維模型。使用PyMOL軟件對LMsp的蛋白質三維模型進行分析，并結合與另外2個氨基酸序列相差較小，但轉糖苷性質差異較大的兩個序列的比對結果（分別來自于腸膜明串珠菌NRRL B1149、腸膜明串珠菌NRRL B1355的蔗糖磷酸化酶），找到了3 個可能影響LMsp轉糖苷活性的關鍵氨基酸殘基，并進行突變改造。突變引物如表1所示。

表1 反向PCR引物Table 1 Primer sequences used for inverse-PCR

定點突變PCR程序：除退火溫度為57 ℃外，其他條件同1.3.1節。PCR產物中加入Dpn I酶消解質粒模板，膠回收后將PCR產物轉入E. coli XL10-Gold中經過測序獲得正確突變體。并且在單點突變體基礎上，進行累積突變，獲得T180A-T219V、T180A-P236S、T219V-P236S和T180A-T219V-P236S四個聯合突變體。

蔗糖磷酸化酶LMsp突變體的誘導表達參照1.3.2節進行；酶學性質測定及轉糖苷性質研究參照1.3.3節進行。

2 結果與分析

2.1 蔗糖磷酸化酶的生物信息學分析和基因克隆

使用SMART軟件對腸膜明串珠菌ATCC12291的蔗糖磷酸化酶基因所編碼的氨基酸序列進行蛋白質結構組件分析。生物信息學分析與基因克隆結果如圖1所示。結果表明其N端30～337位氨基酸為α-淀粉酶結構域，不具有信號肽。以腸膜明串珠菌ATCC12291的基因組DNA為模板，用引物LMsp-F、LMsp-R按照1.3.1節中方法PCR擴增目的基因，得到一條大小約為1.5 kb的特異性條帶，測序正確后將其命名為lmsp，對應的蛋白質大小預計為55 848.77 Da。

圖1 LMsp蛋白質結構組件（A）及目的基因的克隆（B）Fig. 1 Modular architecture (A) and cloning (B) of target gene

2.2 重組酶LMsp的誘導表達和蛋白質純化

重組菌誘導后裂解物菌體蛋白的SDS-PAGE分析如圖2所示。含有重組質粒的菌株約在56 kDa大小處表達有明顯的蛋白質特征條帶，與理論分子質量一致。純化后的重組蛋白LMsp在預期大小處的條帶明顯且單一，說明目的蛋白符合預期，即lmsp已在宿主菌內成功表達，可進一步測定酶學性質。

圖2 重組蛋白LMsp的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein LMsp

2.3 重組酶LMsp的酶學性質分析

2.3.1 pH值和溫度對于重組酶LMsp的影響

如圖3A、B所示，LMsp的最適pH值為6.5，在pH 5.5～7.5之間能保持50%以上的酶活力。最適溫度為40 ℃，在30～45℃之間能保持50%以上的酶活力。

LMsp在pH 4.5～8.0的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中4 ℃保存24 h后，殘余酶活力在70%以上（圖3C），說明在此范圍內LMsp的酸堿穩定性較好。在25～40 ℃條件下水浴保溫1 h后，仍殘留有50%以上的酶活力，其中在25～35 ℃時能穩定保留有80%以上的酶活力（圖3D）。

圖3 pH值和溫度對重組蛋白質LMsp酶活力的影響Fig. 3 Effect of pH and temperature on recombinant enzyme activity

2.3.2 LMsp的動力學常數測定結果

利用GraphPad Prism 5軟件對所測酶活數據進行處理，通過非線性回歸擬合得到動力學常數（圖4）Km為（34.16±1.219）mmol/L，Vmax值為（370.5±6.049）μmol/（mg·min）。

圖4 LMsp的Km和Vmax值Fig. 4 Km and Vmax values of LMsp

2.3.3 LMsp轉糖苷功能分析

在以15%的葡萄糖-1-磷酸為供體，受體為5%的糖類時，檢測反應產物并計算轉化率如表2所示。可知LMsp對D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖醇、D-半乳糖、D-甘露糖、D-果糖、D-葡萄糖、L-山梨糖具有轉糖苷活性，尤其對L-阿拉伯糖具有75%的轉化效率。

表2 LMsp轉糖苷產物的轉化率Table 2 HPLC analysis of transglycosidase products from LMsp

2.4 LMsp的分子改造

2.4.1 LMsp的同源建模分析與突變位點的選擇

選擇來自與蔗糖磷酸化酶LMsp氨基酸序列一致性大于30%（序列一致性為36.58%）的青春雙歧桿菌3D結構為模板，使用SWISS-MODEL建立了LMsp的蛋白質三維結構。找出了距離LMsp催化親核試劑196位天冬氨酸10 ?以內的氨基酸殘基位點（圖5中的橘黃色棒狀物）。

圖5 距離LMsp催化親核試劑10 ?以內的氨基酸殘基Fig. 5 Amino acid residues from the catalytic nucleophile of LMsp within 10 ?

已有研究[19]發現來自腸膜明串珠菌NRRL B1149和腸膜明串珠菌NRRL B1355的蔗糖磷酸化酶與LMsp有高達86%以上的氨基酸序列相似性，但轉糖苷活性差別較大，因此推測2 種菌中不同的氨基酸殘基中包含有影響轉糖苷活力的關鍵位點。

結合LMsp同源建模所找到的距離催化親核試劑10 ?以內的氨基酸殘基位點，并根據序列比對分析的結果，找出了3 個可能影響LMsp轉糖苷活性的氨基酸殘基位點，即T180、T219、P236，如圖6所示。將這3 個位點突變成為腸膜明串珠菌NRRL B1355氨基酸序列上所對應的T180A、T219V、P236S，并在此基礎上進行累積突變，直至獲得LMsp在180、219、236三個位點上的全部7 個突變體。

圖6 LMsp突變位點的選擇Fig. 6 Selection of mutation site in LMsp

2.4.2 突變體的獲得與突變蛋白的表達純化

用表1中引物，以pQE-lmsp為模板反向PCR擴增得到目的產物，將測序正確的突變質粒轉入E. coliM15/pREP4中得到突變體。突變體經誘導表達并使用鎳親和層析純化，純化后的7 個突變蛋白分子質量大小一致，約為56 kDa，與預期大小相符。SDS-PAGE分析結果如圖7所示。

圖7 突變蛋白SDS-PAGE分析Fig. 7 SDS-PAGE analysis of purified mutant proteins

2.4.3 突變酶酶學性質

將所得突變體，按照1.3.3節中的酶活測定方法，對比野生酶LMsp結果如表3所示。突變酶的最適溫度和最適pH值與野生重組酶LMsp相比變化不大，Km、Vmax值較野生酶相比變化明顯。其中T180A的Km值為（77.74±5.671）mmol/L，比野生酶高出（43.58±4.452）mmol/L，提高了約1.28 倍，該突變體對蔗糖的親和力降低最大。同時也得到了對于底物親和力提高的突變體T219V-P236S。突變酶T180A的Vmax值（（618.1±23.37） μmol/（min·mg））比野生酶高出（247.6±17.321）μmol/（min·mg），酶活力顯著上升。而其余各突變酶的Vmax值與野生酶相比均有不同程度的下降，其中P236S、T180A-T219V、T180A-P236S及T219V-P236S的Vmax值與突變前相比下降幅度較明顯，分別約為之前的60%、41%、63%和60%。

表3 突變體酶學性質測定結果Table 3 Enzymatic properties of mutants

2.4.4 突變體轉糖苷功能

由表4可知，在以15%的葡萄糖-1-磷酸為供體，受體底物為5%糖類時，LMsp及其突變體對L-阿拉伯糖均有很高的轉糖苷活性。與野生重組酶相比，突變酶T180A、P236S對L-山梨糖的轉糖苷活性提高了約15%；T180A、P236S、T180A-P236S對L-阿拉伯糖的轉糖苷活性基本不變；T180A、T219V、T180A-T219V對D-果糖的轉糖苷活性基本不變；P236S、T219V-P236S對D-葡萄糖的轉糖苷活性與野生酶基本一致；T180A、T219V-P236S、T180A-T219V-P236S對D-木糖醇的轉糖苷活性基本不變；P236S對D-甘露糖，T219V對L-山梨糖的轉糖苷活性同野生酶相當。除此之外，其他突變體對各受體底物的轉糖苷活性都有不同程度的下降，甚至對部分底物失去活性。

表4 LMsp及突變體對底物的轉化率Table 4 Conversion efficiencies of LMsp and mutants toward substrate

3 討 論

本研究從腸膜明串珠菌ATCC 12291基因組中克隆得到了蔗糖磷酸化酶基因lmsp，并在大腸桿菌M15中成功實現了異源表達。目的酶蛋白分子質量大小約為56 kDa，最適溫度為40 ℃，最適pH值為6.5，在25～40 ℃、pH 4.5～8.0條件下能保持酶活力穩定。Lee等[20]報道來自腸膜明串珠菌NRRL B1149的蔗糖磷酸化酶的最適溫度為37 ℃，李群良等[21]測定來源于Bacillus megateriumNCIB 8508的蔗糖磷酸化酶最適溫度為50 ℃，最適pH值為7.5，一定程度上表明不同來源的酶在酶學性質上表現有差異，這是在菌株需要不斷適應外界環境而長期進化造成的。在以蔗糖為底物時Km為（34.16±1.219）mmol/L，Vmax值為（370.5±6.049）μmol/（mg·min）。LMsp對D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖醇、D-半乳糖、D-甘露糖、D-果糖、D-葡萄糖、L-山梨糖具有轉糖苷活性。

為找到影響轉糖苷反應的關鍵殘基位點，以提高轉糖苷活性，對其進行了分子改造。依據Morler等[22]的距離定義即：離活性中心距離超過10 ?即被認定為遠距離位點。以青春雙歧桿菌蔗糖磷酸化酶的3D結構為模板，建立了LMsp的蛋白質三維模型。并結合同源蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列比對分析，選取了距離LMsp親核試劑Asp 196位點10 ?以內的T180、T219、P236三個位點進行了定點及累積突變，獲得了7 個近距離突變體。其中突變體T180A、P236S對L-山梨糖的轉糖苷活性有所提高，對其他一些受體底物則出現了反向變化。

為解釋性質改善的原因，經過分析發現，蘇氨酸與丙氨酸相比，R基上多一個羥基和甲基，空間結構較復雜。脯氨酸是一種有著環狀結構的亞氨基酸，其空間結構比絲氨酸更加復雜，空間位阻更大。因此當180、236位點上的蘇氨酸和脯氨酸突變成為空間位阻較小的丙氨酸和絲氨酸時，酶的活性口袋更容易與底物相契合，使得酶對這些底物的轉糖苷活性上升。突變體T180A、P236S對L-山梨糖的轉糖苷活性均有所提高，而T180AP236S聯合突變體對于山梨糖的活性卻發生了降低，即多位點的相互疊加并不會把單點突變的優勢疊加起來，反而造成了活性的減弱。結合建模分析，推測由于突變后氨基酸空間結構改變對相鄰氨基酸產生了影響，酶的空間構象發生變化，造成了底物與酶在誘導契合過程中產生了阻礙作用。

為改善酶學特性，遠距離突變的改造方案也曾被采用，并取得了一定成果。Whittle等[23]曾在距離活性中心19 ?的位置進行了突變，使酶活力增強了32 倍。Van Den Heuvel等[24]在距離活性中心遠達32 ?的位置引入突變，使酶活力增強了4.2 倍。一定程度上表明了遠距離的氨基酸變化可以通過一系列的接觸傳遞到活性中心，從而影響酶活力。此外，基于蛋白質結構能量預測的方法也有很多成功的例子[25-27]，能量最低化對于穩定蛋白性質及提高產物得率也是一個很好的方法。本研究豐富了蔗糖磷酸化酶資源的性質數據，獲得了部分性質具有改善的突變酶，為進一步對于蔗糖磷酸化酶的分子改造提供了寶貴經驗。