Plackett-Burman和Box-Behnken 試驗優化嗜熱鏈球菌Q4F8產胞外多糖工藝

劉 剛，梁 琪*，宋雪梅，張 炎

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是乳酸菌生長和代謝過程中產生到外界環境中的復雜長鏈、高分子聚合物，是莢膜多糖或細胞壁外分泌的黏液多糖的總稱[1]。研究表明，EPS具備功能方面的多種特性，在生理上，EPS表現出良好的抗氧化活性、增強免疫、抗氧化、抗腫瘤細胞產生等；在物化特性上，EPS是一種安全無毒的增稠劑、穩定劑和黏性發酵劑應用于乳品行業[2]；在酸奶中，EPS可以改善酸乳的質地和口感，使酸乳的持水力提高[3]。

全球每年7萬 t多糖用于食品領域中作為增稠劑和穩定劑。乳酸菌EPS有廣闊的工業應用價值，但由于其EPS產量低，乳酸菌菌株穩定性差，因而在工業生產中規模性應用受到限制[4]，因此，乳酸菌EPS產量的提高是目前急需解決的難題。要想解決這一難題，就必須篩選高產菌株及其發酵條件進行優化。微生物EPS不僅受到自身菌落的影響，而且受到溫度、壓力和光照強度等生長環境的顯著影響，其培養條件、培養基成分的不同，不僅造成乳酸菌EPS產量有影響，甚至會影響其結構和功能性質。目前乳酸菌EPS研究中，優化后乳酸菌菌株EPS產率在17.8%～28.75%有不同程度的提高[5]。因此，通過優化發酵工藝可有效提高菌株EPS產量。此外，響應面分析法已廣泛應用于許多生物技術過程，如培養條件和一些生物物質生產的優化[6]，它克服了傳統方法的不足，在培養條件和工藝參數方面取得了良好的優化效果[7]。

本實驗以甘肅藏區牦牛乳中篩選得到的嗜熱鏈球菌Q4[8]為野生菌株，誘變后得到的突變株Q4F8為優化菌株，以EPS含量為響應值，優化培養條件及培養基組成，旨在進一步提高EPS的產量，為乳酸菌菌類多糖的工業化生產提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）Q4由甘肅省功能乳品工程實驗室分離純化并于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保藏。

1.1.2 培養基

GM17培養基：多聚蛋白胨5 g，植物蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，牛肉膏5 g，乳糖5 g，抗壞血酸鈉0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，磷酸二氫鉀5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH 6.9±0.2，于121 ℃高溫滅菌20 min。

脫脂乳培養基：12%的脫脂乳，于115 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、魚蛋白胨、Na2HPO4、NaH2PO4、硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）、Na2S2O3、98%無水乙醇、濃硫酸、氯化鈉、三氯乙酸、苯酚等均為分析純。

1.2 儀器與設備

723型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；YX280型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司；紫外燈 南京華強電子有限公司；LVDV-1數字旋轉黏度計 上海方瑞儀器有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；85-2控溫磁力攪拌器 金壇市恒豐儀器廠；DW-86L386立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；電熱恒溫培養箱、電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；GZX-GF101-2-BS-II電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械有限公司；NRY-200恒溫搖床 上海南榮實驗室設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與菌懸液制備[9]

取實驗室甘油管中凍藏的嗜熱鏈球菌菌株Q4解凍，脫脂乳中培養3 次。將活化后的菌2 環接種于裝有GM17液體培養基30 mL的250 mL三角瓶中，37 ℃恒溫培養24 h，形成種子液。按3%種子液轉接到另一瓶GM17液體培養基中，相同條件下，培養至對數生長期的培養液，取出菌液4 000 r/min、4 ℃冷凍離心15 min。收集菌體并用0.85%無菌生理鹽水洗滌，最后將菌體懸浮于無菌生理鹽水中且調整細胞濃度為108CFU/mL作為待處理細菌懸浮液，于4 ℃冰箱保藏備用。

1.3.2 菌株EPS含量測定

葡萄糖標準曲線的繪制參照薩如拉等[10]的方法并稍作修改。已有研究證實，在加熱條件下采用酸-乙醇沉淀的方法，多糖提取率可以提高60%[11]。多糖在濃硫酸的作用下先水解為單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，通過比色法測定糖含量，葡萄糖標準曲線的回歸方程為：y=0.009 1x-0.001，R2=0.998 1。

參照文獻[12-13]的方法并稍作修改。將10 mL GM17發酵液（發酵30 h）在95 ℃水浴鍋中加熱10 min，以此達到去酶活性的目的；待冷卻后置于冷凍離心機中4 ℃、8 000 r/min離心。15 min后收集上清液并加入5 mL 12% TCA溶液，封口膜封口，放在160 r/min搖床上反應1 h并且讓其靜置30 min。再次4 ℃、8 000 r/min冷凍離心15min后收集上清液，將3 倍體積的無水乙醇加入到上清液中，封存于4 ℃冰箱隔夜沉淀（24 h）；取沉淀4 ℃、8 000 r/min冷凍離心15 min，然后沉淀用去離子水溶解沉淀物，與去離子水中透析3 d，每4 h換水一次，冷凍干燥得粗多糖。EPS含量的測定采用硫酸-苯酚法[14]。

1.3.3 菌株的誘變篩選[15]

采用改裝的超凈工作臺進行紫外和DES的復合誘變，篩選出遺傳性能穩定的EPS高產誘變菌株。最佳紫外誘變條件為：誘變距離25 cm，誘變時間150 s；最佳DES誘變條件為：DES體積分數1.0%，誘變溫度36 ℃，誘變時間26 min。

1.3.4 菌株特性分析

為得到活力優良的菌株，需要將菌株的生長情況、OD值等進行測定，將誘變前和誘變后活化的菌株，按3%的比例接種于GM17培養基，37 ℃恒溫培養，每2 h取樣，測定菌液的pH值、OD600nm、活菌數，連續測定至24 h，以時間和生長特性作圖繪制嗜熱鏈球菌的生長曲線。

1.3.5 培養基單因素試驗

在GM17液體培養基基礎上，選擇不同的碳源和氮源，其他選擇的培養條件為選擇連續活化3 代的菌株、接種量3%、培養溫度37 ℃、初始pH 6.9和培養時間30 h，并測定EPS含量，以EPS為指標確定該嗜熱鏈球菌產EPS的最佳培養條件。

分別選擇質量分數為0.5%的4 種碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖）、0.5%的3 種氮源（胰蛋白胨、大豆蛋白胨、魚蛋白胨）、3 個碳氮比（乳糖-魚蛋白胨-胰蛋白胨1∶1∶1、1∶2∶2、2∶1∶1）、5 個碳源質量分數（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）和5 個pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）做對比試驗，以EPS含量為指標確定最佳碳源、最佳氮源、最佳碳氮比和最佳碳源質量分數。

1.3.6 培養條件單因素試驗

在GM17培養基中，不同的培養條件下采用硫酸苯酚法測定菌體產生的EPS含量，確定該嗜熱鏈球菌產EPS的最佳培養條件。

分別選擇5 個接種量水平（1%、2%、3%、4%和5%）、5 個培養溫度水平（27、32、37、42 ℃和47 ℃）、5 個培養時間水平（20、24、28、32 h和36 h）做對比試驗，以EPS含量為指標確定最佳接種量、最佳培養溫度和最佳培養時間。

1.3.7 Plackett-Burman（PB）試驗設計

根據單因素試驗結果，選取乳糖質量分數（X1）、pH值（X2）、接種量（X3）、培養溫度（X4）和培養時間（X5）5 個因素的水平值，以EPS產量為響應值進行2水平的PB試驗設計及數據處理，確定顯著性影響因素。PB試驗因素與水平設計見表1。

表1 PB試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used for Plackett-Burman design

1.3.8 Box-Behnken試驗設計

根據PB試驗設計結果，選取乳糖質量分數、初始pH值和培養溫度為影響EPS含量的3 個主要因素，以EPS產量為響應值，根據Box-Behnken的設計原理[16]，進行3因素3水平響應面試驗。Box-Behnken試驗因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.9 EPS抑菌性實驗

制備雙層瓊脂平板，分別涂布大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，采用牛津杯打孔法打孔，取真空冷凍干燥的EPS溶解于蒸餾水中，加入預先制備好的孔徑中，于4 ℃擴散4 h，置于37 ℃培養，測量抑菌圈直徑。

1.4 數據統計分析

本研究涉及的數據除葡萄糖標準曲線外，均重復3 次。采用Design-Expert 8.0.6軟件進行PB試驗和Box-Behnken試驗設計及數據處理，用Origin 8.0軟件進行繪圖處理，SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，采用ANOVA，并選用Duncan多重比較進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 復合誘變選育高產EPS菌株

圖1 復合誘變菌株選育Fig. 1 Exopolysaccharide yields of the original and mutant strains

對實驗室保藏的菌株Q4在最佳條件下進行先化學（DES）后紫外的復合誘變，經過菌落特征和黏度的初篩（篩選菌落直徑大、邊緣整齊、顯微鏡觀察為鏈球狀的菌落），EPS的復篩以及菌株的穩定性分析，篩選出1 株穩定性良好的高產EPS嗜熱鏈球菌菌株Q4F8，突變株比原始菌株產量提高80.95%（圖1）。

2.2 菌株的生長特性分析

圖2 嗜熱鏈球菌的生長曲線Fig. 2 Growth curves of Streptococcus thermophiles Q4 and Q4F8

由圖2可以看出，經誘變后菌株比初始菌株對數期提前，且達到穩定期時誘變菌株比原始菌株菌體濃度和OD值均有所提高，說明發酵活力和生物量都有不同程度的提高。突變株更有利于吸收外界環境營養，能更好地繁殖和產生代謝產物。

2.3 培養基成分對嗜熱鏈球菌Q4F8產EPS的影響

2.3.1 碳源種類對EPS的影響

圖3 碳源對Q4F8菌株EPS產量的影響Fig. 3 Effect of carbon sources on EPS yield of Q4F8

除菌株自身遺傳因素外，其培養基組成（碳源、氮源）也會對乳酸菌EPS產量造成很大影響[17]。因此，可通過優化EPS的合成條件提高菌株產EPS能力。由圖3可知，嗜熱鏈球菌Q4F8可利用多種碳源合成EPS。其中半乳糖作為碳源時，EPS產量最少，為98.68 mg/L，并且和其他碳源相比存在顯著差異（P＜0.05）。當碳源為乳糖時，Q4F8 EPS產量最高，達到154.21 mg/L（P＜0.05）。說明嗜熱鏈球菌Q4F8利用可分解乳糖，利用乳糖能力強，這與Cheirsilp[18]和Desaia[19]等的研究一致，以乳糖為碳源時，EPS產量最高。

2.3.2 氮源種類對EPS的影響

圖4 氮源對Q4F8菌株EPS產量的影響Fig. 4 Effect of nitrogen sources on EPS yield of Q4F8

乳酸菌合成EPS時，氮源是必須的營養成分，氮源種類和添加量的不同都會對菌株分泌EPS造成不同影響[20-21]。由圖4可以看出，多種氮源對菌株的發酵產糖有不同影響。當氮源為魚蛋白胨時，該菌株合成EPS最大，其次為胰蛋白胨，最后是大豆蛋白胨，3 種氮源對菌株Q4F8合成EPS具有顯著性差異（P＜0.05），說明嗜熱鏈球菌Q4F8利用動物蛋白胨作氮源的能力優于植物蛋白胨。氮源通過影響乳酸菌的生長，使菌體的密度增加，從而影響EPS的產量[22]。

2.3.3 碳氮比對EPS的影響

圖5 碳氮比對Q4F8菌株EPS產量的影響Fig. 5 Effects of carbon to nitrogen ratio on EPS yield of Q4F8

碳氮比對菌株的生長和代謝有直接影響，碳氮比相對低時，有利于菌體生長，相反，碳氮比相對較高時則變化不顯著，但當碳氮比過高時，相當于滲透壓升高，影響了菌體的生長代謝功能[23]。由圖5可以看出，不同碳氮比對菌株Q4F8合成EPS存在顯著性差異（P＜0.05）。而當碳氮比在1∶2∶2和2∶1∶1時，其無差異顯著性（P＞0.05）。考慮到EPS產量的差別，碳氮比在2∶1∶1的條件下其EPS要高于1∶2∶2，其次從原料的經濟基礎上考慮。因此，選擇碳氮比2∶1∶1為最佳碳氮比進行下一步試驗。

2.3.4 碳源（乳糖）質量分數對EPS的影響

圖6 乳糖質量分數對Q4F8菌株EPS產量的影響Fig. 6 Effect of lactose concentration on EPS yield of Q4F8

碳源是乳酸菌菌株細胞生長及其重要的能量來源，對EPS產量有很大影響[24]，碳源影響EPS合成相關的酶從而對EPS的合成造成影響。如圖6所示，不同質量分數乳糖對菌株Q4F8合成EPS的影響存在顯著性差異（P＜0.05）。乳糖溶液在1.0%～1.5%范圍內，菌株合成EPS的能力呈上升趨勢，其中1.5%時EPS最高。乳酸菌菌體細胞中含有碳源的反饋抑制體系[25]，當乳糖高于1.5%時，其EPS產量呈現下降趨勢，表現出高濃度抑制EPS合成的現象。

2.4 發酵條件對嗜熱鏈球菌Q4F8產EPS的影響

2.4.1 初始pH值對菌株Q4F8產EPS的影響

圖7 pH值對Q4F8菌株EPS產量的影響Fig. 7 Effect of pH value on EPS yield of Q4F8

不同的乳酸菌其生長特性與合成EPS都有最適的pH值范圍。pH值對菌體的代謝影響主要是通過影響細胞膜功能和營養物質的離子化程度影響代謝[23]。由圖7可以看出，pH值太高或太低都不利于其EPS的合成，在pH 5.5～6.5時變化差異顯著（P＜0.05），菌株Q4F8合成EPS在pH 6.5時達到最大值，初始pH值大于6.5時，其EPS產量降低水平不明顯（P＜0.05）。說明菌株Q4F8在中性環境下，更有利于其代謝產物的積累，其最適pH值為6.5。

2.4.2 接種量對菌株Q4F8產EPS的影響

由圖8可知，當接種量在1%～4%時，由于培養基中營養豐富，伴隨著接種量的增加，菌株合成EPS的能力也在增加。當接種量超過4%時，菌株合成EPS的能力呈下降趨勢，在營養成分一定時，接入過多菌種，其營養物質加速消耗，用于合成EPS的能力不足，導致EPS產量下降，與Raza等[26]報道的結果一致。當接種量為3%時，EPS產量最高。

圖8 接種量對Q4F8菌株EPS產量的影響Fig. 8 Effects of inoculum amount on EPS yield of Q4F8

2.4.3 培養溫度對菌株Q4F8產EPS的影響

圖9 培養溫度對Q4F8菌株EPS產量的影響Fig. 9 Effects of fermentation temperature on EPS yield of Q4F8

由圖9可以看出，培養溫度對嗜熱鏈球菌Q4F8合成EPS的影響差異顯著（P＜0.05）。隨著溫度的升高，合成EPS產量增加，當溫度為42 ℃時，EPS產量最大，隨后隨著溫度的升高，EPS產量呈下降趨勢。說明低溫和高溫環境都會抑制乳酸菌EPS的合成，低溫時菌體生長緩慢，數量不足，進而影響其合成，高溫時可能導致合成EPS的酶活性下降。因此，本試驗選擇42 ℃為最佳培養溫度。

2.4.4 培養時間對菌株Q4F8產EPS的影響

圖10 培養時間對Q4F8菌株EPS產量的影響Fig. 10 Effect of fermentation time on EPS yield of Q4F8

如圖10所示，隨著時間的延長，EPS產量呈現先增大后減小的趨勢，下降可能是由于酶解條件或者營養環境惡化等參數的改變所致[27]。隨著時間的延長合成EPS產量呈現顯著性差異（P＜0.05），Q4F8在培養28 h時，其EPS產量達到最大值。隨著培養時間的延長，菌體出現自溶現象，分解出代謝多糖的酶，進而降低EPS產量。

2.5 PB試驗結果

表3 PB試驗設計及結果Table 3 Plackett-Burman design with experimental results

PB試驗根據2水平的試驗設計，通過比較2水平因素的差異性和整體的差異性確定因素之間的顯著性，篩選因素達到節約試驗耗材、提高試驗響應值的目的[28]。PB試驗設計及響應值見表3。利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3數據進行處理，由表4可知，模型F值為55.41，表明該模式具有重要意義，R2=0.978 8，說明存在97.88%的試驗數據可用該模型解釋。對合成EPS影響極顯著（P＜0.01）的因素依次為X1＞X2＞X4＞X3，X5對合成EPS影響顯著（P＜0.05）。因此，選取乳糖質量分數、pH值和培養溫度3 個因素進行Box-Behnken試驗。

表4 PB試驗方差分析Table 4 Analysis of variance of experimental results from Plackett-Burman design

2.6 Box-Behnken試驗設計結果

Box-Behnken試驗設計水平及響應值見表5，對其數據進行處理的方差分析見表6。該模型差異極顯著（P＜0.01）。模型的失擬項無顯著性差異（P=0.216 6＞0.05），說明所選的模型擬合程度好，可較好地擬合試驗結果。確定系數R2為0.995 4，和調整確定系數R2Adj為0.989 4基本接近，表明模型的回歸方程和相關性都很好。因此，Box-Behnken設計是可靠的，該模型可較好地應用于嗜熱鏈球菌合成EPS的理論預測。模型一次項X1對響應值EPS產量影響達到顯著水平（P＜0.05），一次項X2、X3對響應值EPS產量影響達到極顯著水平（P＜0.01）；交互項X1X2、X1X3對響應值EPS產量影響不顯著（P＞0.05），X2X3對響應值EPS產量影響達到極顯著水平（P＜0.01）；平方項X12、X22、X32對響應值EPS產量影響達到極顯著水平（P＜0.01）；3 個因素對合成EPS的影響大小依次為：X2＞X3＞X1，表明，3 個因素并不是簡單的線性關系。經修正不顯著項后，多元回歸擬合模型的二次多項式方程為：

表5 Box-Behnken試驗設計及結果Table 5 Box-Behnken design with experimental results

表6 Box-Behnken試驗方差分析Table 6 Analysis of variance of experimental results from Box-Behnken design

2.7 各因素之間響應面交互作用分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行響應面圖繪制，通過響應面可直觀地分析各因素及因素相互之間的交互作用對響應值的影響[29]。各因素之間響應面3D圖和等高線圖能直觀反映出其相互作用的強弱，橢圓形的等高線表示兩因素之間的交互作用存在顯著性差異，圓形則表示兩因素之間交互作用無顯著性差異[30-31]。

圖11 各因素交互作用對EPS產量影響的等高線和響應面圖Fig. 11 Contour and response surface plots showing the interactive effects of various factors on EPS production

圖11 a可以看出，當培養溫度控制在0水平時，乳糖質量分數和pH值的等高線近似圓形，表明乳糖質量分數和pH值的交互作用對EPS的合成影響不顯著；固定乳糖質量分數為一定值，EPS隨著pH值的升高變化不明顯，表明乳糖質量分數和pH值的交互作用對EPS的合成影響不顯著；隨著乳糖質量分數的增加，EPS產量先增加后減小，乳糖質量分數1.40%～1.60%之間，EPS產量最大。

圖11b可以看出，固定pH值制在0水平時，乳糖質量分數和培養溫度的等高線近似圓形，表明乳糖質量分數和培養溫度的交互作用對EPS的合成影響不顯著；乳糖質量分數固定時，隨著培養溫度的升高，EPS產量呈現先增后減小的趨勢，培養溫度在39～40 ℃之間，EPS產量最大。

圖11c可以看出，乳糖質量分數為0水平時，培養溫度和pH值的等高線為橢圓形，表明培養溫度和pH值的交互作用對EPS的合成影響達到顯著水平；固定培養溫度為一定值，其隨著pH值的升高，其EPS呈現增加的趨勢。

2.8 發酵條件的優化及驗證結果

對回歸模型進行優化分析，獲得嗜熱鏈球菌Q4F8合成EPS的最佳工藝條件為pH 6.90、培養溫度為42 ℃、乳糖質量分數1.51%，并且在此條件下EPS產量的理論預測值為189.98 mg/L。在最優條件下進行3 次重復驗證實驗，獲得的EPS產量為191.47 mg/L，與響應面優化預測的結果基本一致，響應面分析方法得到的嗜熱鏈球菌合成EPS的工藝條件真實，在一定程度上具有實際應用價值。

2.9 EPS抑菌性分析

表7 EPS抑菌性實驗Table 7 Antimicrobial activity of the EPS produced by Q4F8

從表7得出，突變株具有較好的抑制食品中常見的三大致致病菌滋生的效果，其中突變株產生的EPS對大腸桿菌抑菌效果最好到達（14.209±0.853）mm。從而在生產中以提高發酵乳制品的貨架期和益生性能有明顯的效果。

3 結 論

突變株有效提高了自身的生長性能，對環境的適應能力更強，更有利于自身菌體的生長及次生代謝產物的生產，尤其是EPS的產生。本研究從碳源和氮源種類、碳源質量濃度、碳氮比、接種量、pH值、培養溫度和培養時間對EPS影響的單因素基礎上，聯和采用PB試驗和Box-Behnken試驗的方法，建立了嗜熱鏈球菌Q4F8發酵EPS條件的多項式模型，經顯著性檢驗分析和響應面分析，其最佳工藝參數為pH 6.90、培養溫度42 ℃和乳糖質量分數1.51%，獲得的理論值為189.98 mg/L。經驗證實際值為191.47 mg/L，證明該模型準確可靠。該研究為今后對此菌株EPS結構、生理功能和機理研究奠定了基礎，同時也為嗜熱鏈球菌Q4F8產EPS的工業化制備和應用提供理論參考。突變株產生的EPS能有效抑制食品中常見的三大致病菌滋生，可更好地用于發酵工業及其食品產業中，以提高發酵產品的貨架期和益生性能，為今后在功能性乳酸菌發酵劑的研究及其產品的貯藏性方面提供進一步的研究基礎。