具有α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶IV 抑制作用降糖益生菌的篩選

閆芬芬，史佳鷺，李 娜，岳瑩雪，李慧臻，宋 月，霍貴成*

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，典型臨床癥狀是高血糖，是由胰島素缺乏、胰島素抵抗或兩者兼有而導致的[1]。國際糖尿病聯盟將糖尿病分為1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和其他類型的糖尿病，其中2型糖尿病患者最多，占總患病人數的85%～95%，主要與全身炎癥[2]和氧化應激[3]增加有關，分子和代謝機制與β細胞功能障礙和胰島素抵抗有關[4]。根據世界衛生組織的數據，2015年全球成人糖尿病患者人數達到4.15億，預計到2040年這一數字將達到6.42億。此外，糖尿病患者逐漸變得年輕化，2017年青少年糖尿病全球發病率為8%，預計到2040年將達到10%[5]。中國已成為世界上糖尿病患者人數最多的國家，糖尿病患者超過1億。由于該疾病的復雜發病機制和眾多影響因素，目前尚無有效的防治措施。

人體攝取的碳水化合物必須通過腸內的關鍵消化酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）水解成葡萄糖單體，以被人體吸收。α-葡萄糖苷酶是一種存在于小腸黏膜刷狀緣的專門負責催化碳水化合物（低聚糖、二糖等）水解的水解酶[6-7]。因此，通過抑制α-葡萄糖苷酶活性降低餐后血糖已成為糖尿病臨床干預的有效靶點。臨床上使用的藥物主要包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。目前，研究發現一些α-葡萄糖苷酶抑制劑主要通過影響酶催化位點和模仿酶作用底物抑制該酶的活性[8-9]。阿卡波糖就是通過模仿酶作用底物治療糖尿病[10]。此外，有一些酶抑制劑不僅具有與底物相似的結構，而且還與酶的活性位點形成共價鍵，從而通過這種競爭性抑制延遲碳水化合物的消化和吸收，降低餐后血糖。二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV）是一種非常穩定的細胞表面的絲氨酸蛋白酶，在腸中高表達，此外在肝臟、胰腺、胎盤、胸腺等也有表達，部分以可溶形式存在于循環血液中，從而作用于組織和器官[11]。DPP-IV可以作用于生理激素，如胰高血糖素樣肽（GLP-1）、肽YY（PYY）等，從而減少其半衰期[12]。目前的研究發現，GLP-1在調節人體糖脂代謝中起重要作用。GLP-1可通過結合相應的受體來減緩胃排空，抑制食欲，增加胰島素的分泌和降低胰高血糖素的分泌。GLP-1還可促進β細胞增殖，抑制β細胞凋亡[13]。因此，抑制DPP-IV的活性，可增加GLP-1半衰期，促進胰島素分泌。此外，GLP-1的促胰島素活性依賴于葡萄糖濃度，從而預防低血糖癥[14]。

近年來益生菌的健康效益越來越受到人們的關注，它在健康和疾病中起著重要作用[15]。益生菌在改善免疫系統功能和預防腹瀉方面具有良好的保健作用[16-17]。研究也證明益生菌具有改善炎癥，降低血脂、血糖，緩解代謝綜合癥的作用[18]。一些動物和臨床實驗證實了益生菌在緩解2型糖尿病中的作用。李向菲[19]發現，產胞外多糖的乳酸菌可以降低鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病小鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白、HOMA-IR指數、腫瘤壞死因子和白細胞介素-6，提高機體對胰島素的敏感性，并通過細胞實驗證實，乳酸菌產生的胞外多糖可以上調與GLP-1合成相關的基因的表達。Lactobacillus reuteri GMNL-263（109CFU/mL））可以顯著降低糖尿病大鼠的空腹血糖、胰島素、肝損傷標志物、脂肪組織中的白細胞介素-6和腫瘤壞死因子，改善血液和肝臟中血脂代謝，增加PPAR-γ和GLUT4基因表達，增加糞便中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量[20]。Jayashree等[21]研究發現，受試者攝入混合多種益生菌酸奶8 周后，糖化血紅蛋白、腫瘤壞死因子、白細胞介素-6顯著降低。Ejtahed等[22]研究發現2型糖尿病患者攝入含有益生菌的酸奶6 周后，空腹血糖、糖化血紅蛋白、氧化應激參數均降低。然而也有研究顯示益生菌無論是單獨食用還是作為食物添加劑食用，均不能有效地降低血糖，緩解2型糖尿病[23]。盡管目前的研究結果存在差異，但并不能排除益生菌能夠緩解糖尿病的潛力。

本實驗以中國傳統乳制品中分離出的13 株乳酸桿菌為研究對象。前期研究發現這些菌株具有抑菌活性[24]，抗氧化性能[25]以及降膽固醇[26]等功能。基于前人研究，首先根據菌株細胞代謝物（cell-free excretory supernatants，CFS）和細胞內容物（cell-free extracts，CFE）對α-葡萄糖苷酶和DPP-IV活性的抑制率進行降糖作用的篩選；在此基礎上，對篩選菌株進行益生特性評價；最后通過主成分分析，從中篩選出性能最優的降糖菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

13 株乳酸桿菌由東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室工業微生物菌種保藏中心提供，鼠李糖乳桿菌LGG ATCC 53103用作參考菌株，并已通過16S rRNA基因測序鑒定。

4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷（p-nitrophenyl-D-galactopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶、甘氨酸-脯氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽 美國Sigma公司；重組人DPPIV ProSpec 艾美捷科技有限公司；diprotin A強耀生物科技公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LDZF-50KB-II立式蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；CJ-2D超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司；DHP-927型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；臺式冷凍高速離心機 美國Sigma公司；UV-2401PC型紫外分光光度計 日本島津公司；JY-92-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Infinite?M1000 Pro多功能酶標儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及其菌落總數的測定

將凍存于-80 ℃甘油保藏的14 株乳酸桿菌以2%（體積分數）的接種量接種到MRS肉湯培養基中，37 ℃培養24 h，連續培養2 次，第3次培養18 h后收集菌液，并將菌液濃度調節為1×109CFU/mL。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1 CFS的制備

乳酸桿菌于MRS培養基中37 ℃靜置培養18 h后，4 ℃、8 000 r/min離心15 min收集菌體。用無菌0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 6.8）洗滌2 次，將菌體重懸于PBS中，并將細菌濃度調至1×109CFU/mL。37 ℃孵育12 h，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，將上清液通過0.22 μm水系微濾膜過濾以獲得CFS，-80 ℃保存。

1.3.2.2 CFE的制備

乳酸桿菌在MRS培養基中于37 ℃培養18 h后，4 ℃、8 000 r/min離心15 min以收集菌體。無菌0.1 mol/L PBS（pH 6.8）洗滌2 次，菌體重懸于PBS中，將菌液濃度調至1×109CFU/mL，并在冰浴條件下超聲破碎。超聲破碎的條件為：功率200 W，以3 s-5 s（工作3 s，停5 s）的脈沖破碎15 min。超聲后的破碎液在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將上清液通過0.22 μm水系微濾膜過濾以獲得CFE，-80 ℃保存。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

按照文獻[27]的方法，取96 孔微量滴定板，向反應孔中加入25 μL 2.5 mmol/L PNPG和25 μL CFS或CFE；于37 ℃孵育10 min，再加入50 μL 0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶；37 ℃反應15 min，最后加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應，使用酶標儀于波長405 nm處檢測反應溶液的吸光度（A）。以阿卡波糖為陽性對照，抑制率計算如式（1）所示：

式中：陽性為PNPG＋PBS（0.1 mol/L，pH 6.8）＋酶＋Na2CO3；陰性為PNPG＋PBS（0.1 mol/L，pH 6.8）＋PBS（0.1 mol/L，pH 6.8）＋Na2CO3；樣品為PNPG＋樣品＋酶＋Na2CO3；樣品空白為PNPG＋樣品＋PBS（0.1 mol/L，pH 6.8）＋Na2CO3。

1.3.4 DPP-IV抑制活性的測定

按照文獻[28]的方法，取96 孔微量滴定板，在反應孔中加入25 μL 0.2 mmol/L甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯和25 μL CFS或CFE；于37 ℃孵育10 min，再加入50 μL 0.01 U/L DPP-IV；37 ℃反應60 min，最后加入100 μL 1 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（pH 4.0）終止反應，使用酶標儀在波長405 nm處檢測反應溶液的吸光度。以抑二肽素作陽性對照，抑制率計算如式（2）所示：

式中：陽性為甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺＋Tris-HCl buffer（100 mmol/L，pH 8.0）＋DPP-IV＋醋酸鈉緩沖溶液；陰性為甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺＋Tris-HCl buffer（100 mmol/L，pH 8.0）＋Tris-HCl buffer＋醋酸鈉緩沖溶液；樣品為甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺＋樣品＋DPP-IV＋醋酸鈉緩沖溶液；樣品空白為甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺＋樣品＋Tris-HCl buffer（100 mmol/L，pH 8.0）＋醋酸鈉緩沖溶液。

1.3.5 益生菌特性

1.3.5.1 酸耐受實驗

4 株乳酸桿菌在MRS培養基中培養18 h，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，收集菌體，菌體用PBS（pH 7.2）洗滌2 次，重懸于PBS。處理后的菌體分別放入pH 2.0和pH 3.0的無菌PBS中，并調整菌體的濃度至109CFU/mL，37 ℃培養0、1、2 h和3 h，取樣進行菌落計數，結果表示為lg（CFU/mL）。

1.3.5.2 膽鹽耐受實驗

根據文獻[29]的方法，4 株乳酸桿菌以2%接種量，接種于MRS（含有0.3%膽鹽）培養基中，37 ℃條件下連續培養8 h，每隔1 h檢測波長620 nm處的吸光度，并將不含有膽鹽的MRS作為對照。膽鹽耐受能力用含有0.3%膽鹽MRS的營養肉湯中，A620nm達到0.3 個單元所需的時間與不加膽鹽的MRS的營養肉湯所需時間的差值表示。

1.3.5.3 疏水性實驗

根據文獻[30]的方法，將乳酸桿菌以2%接種量接在MRS液體培養基中，并在37 ℃培養24 h，以同樣的方式培養3 代，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集18 h的菌體，用無菌的PBS（pH 7.4）沖洗2 次，最后懸浮于PBS（pH 7.4）中。將菌液的濃度調至1×108CFU/mL，并檢測波長600 nm處的OD值。取3.0 mL菌懸液分別與1.0 mL二甲苯、氯仿、乙酸乙酯混合，旋渦振蕩2 min后室溫靜置30 min，出現分層，小心吸取水層，600 nm波長處測定水相的OD值，實驗重復3 次，根據式（3）計算疏水性：

1.3.6 主成分分析

首先篩選具有高α-葡萄糖苷酶和DPP-IV抑制活性的菌株，然后對篩選菌株的α-葡萄糖苷酶和DPP-IV抑制活性、酸耐受性、膽鹽耐受性、細胞疏水性指標進行主成分分析，以期篩選出性能最優的降糖菌株。

1.4 數據統計分析

應用SPSS 17.0進行數據處理，顯著性分析和主成分分析，Origin 9.0進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 具有α-葡萄糖苷酶抑制活性菌株的篩選

表1 乳酸桿菌對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率Table 1 α-Glucosidase inhibitory rate of Lactobacillus

如表1所示，14 株乳酸桿菌的CFS對α-葡萄糖苷酶具有不同的抑制作用，抑制率為0%～12.13%。其中嗜酸乳桿菌KLDS1.0901、KLDS1.1003和參考菌株LGG的CFS顯示出更好的抑制活性，分別為12.13%、10.29%和10.89%，顯著高于其他菌株（P＜0.05）。鼠李糖乳桿菌KLDS1.0205、植物乳桿菌KLDS1.0318、KLDS1.0344、KLDS1.0386和德式乳桿菌保加利亞亞種KLDS1.0207對α-葡萄糖苷酶活性無抑制作用。所有受試乳酸桿菌的CFE未顯示出對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

2.2 具有DPP-IV酶抑制活性菌株的篩選

表2 乳酸桿菌對DPP-IV活性的抑制率Table 2 DPP-IV inhibitory rate of Lactobacillus

由表2可以看出，14 株乳酸桿菌的CFS對DPP-IV表現出不同的抑制效果，抑制率為0%～7.13%。其中嗜酸乳桿菌KLDS1.1003和德式乳桿菌保加利亞亞種KLDS1.0207的CFS顯示出較好的抑制活性，兩者分別為7.13%和5.47%，顯著高于其他菌株（P＜0.05）。鼠李糖乳桿菌KLDS1.0911、植物乳桿菌KLDS1.0344和參考菌株LGG的CFS對DPP-IV無抑制作用。CFE對DPP-IV的抑制率為0%～55.42%，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901具有最高的抑制率55.42%，其次是嗜酸乳桿菌KLDS.1003，抑制率為50.14%，參考菌株LGG抑制率為6.22%。

2.3 益生菌特性分析

2.3.1 益生菌的酸耐受性

圖1 乳酸桿菌對pH 2.0和pH 3.0的酸耐受性Fig. 1 Viability of three selected strains at pH 2.0 or 3.0

由圖1可知，3 株受試菌株和1 株參考菌株對pH 3.0具有較強的耐受性，并且可以存活3 h。在pH 2.0的酸性條件下孵育1 h后，所有菌株的活菌數顯著下降；孵育2 h后，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901和KLDS1.0902有存活菌數；孵育3 h后，僅有嗜酸乳桿菌KLDS1.0901有存活率。與所有其他菌株相比，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的酸耐受最強。

2.3.2 益生菌的膽鹽耐受性

表3 乳酸桿菌的膽鹽耐受性Table 3 Effect of bile on the growth rate of selected strains

從表3可以看出，4 株乳酸桿菌能夠在含0.3%膽鹽的MRS培養基中生長。其中菌株LGG的膽鹽耐受性最好，滯后時間最短為2.06 h，嗜酸乳桿菌KLDS1.0902對膽鹽的耐受能力最差，滯后時間最長為3.26 h，但嗜酸乳桿菌KLDS1.1003和LGG差異不顯著（P＞0.05），說明嗜酸乳桿菌KLDS1.1003和LGG更能耐受腸道膽鹽環境。

2.3.3 益生菌的疏水性

圖2 乳酸桿菌的表面疏水性Fig. 2 Cell surface hydrophobicity of selected strains

圖2 為4 株乳酸桿菌在二甲苯、乙酸乙酯和氯仿3 種有機溶劑中疏水性的結果。在二甲苯溶劑中，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003和KLDS1.0901的疏水性較高，疏水率分別為134.33%和130.58%，而LGG具有最低的疏水性。在乙酸乙酯溶劑中，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的疏水性最高，顯著高于其他菌株（P＜0.05）。在氯仿溶液中，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003具有最高的疏水性，疏水性為344.08%。通常，高疏水性的菌株對細胞具有強黏附性，疏水性實驗結果顯示，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003具有較好的疏水性，該菌株可能具有較強的黏附能力。

2.3.4 主成分分析

圖3A為各個特性在各主成分中占的載荷分布圖。第1主成分可以解釋4 個特性：其成分載荷分別為酸耐受性0.982、CFE對DPP-IV的抑制性0.920、在乙酸乙酯中的疏水性0.867、在二甲苯中的疏水性0.845；第2主成分主要解釋3 個特性：膽鹽耐受性-0.787、在氯仿中的疏水性0.785、CFS對DPP-IV的抑制性0.726、CFS對α-葡萄糖苷酶的抑制性0.564。

圖3B展示了所選益生菌的分布，根據圖3B和表4可以看出，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003的綜合得分最高，為1.21，明顯高于其他3 種菌株，LGG的綜合得分最低。該結果表明嗜酸乳桿菌KLDS1.1003可用作潛在的降糖益生菌。

圖3 主成分分析的因子載荷圖（A）和因子得分圖（B）Fig. 3 Loadings and scores plots of principle components analysis

表4 因子得分Table 4 Scores of fi rst two principal components

3 討 論

以實驗室保藏的13 株乳酸桿菌為研究對象，從菌株的CFS和CFE分析菌株對α-葡萄糖苷酶和DPP-IV的抑制活性，以期篩選出能夠通過抑制α-葡萄糖苷酶和DPP-IV活性而發揮降糖作用的益生菌。糖尿病的典型臨床癥狀為高血糖。因此，在糖尿病早期階段控制糖尿病患者的餐后血糖尤為重要。通過抑制人體糖代謝吸收的關鍵酶（α-葡萄糖苷酶）的活性，減少葡萄糖的吸收，從而降低餐后高血糖的影響。目前，臨床上常見的α-葡萄糖苷酶抑制藥物對人體有不可忽視的副作用。因此，近年來關于植物多糖[31]、黃酮[32]等天然物質對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究增多。本實驗研究了乳酸桿菌對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，結果表明，多數菌株的CFS對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，尤其是嗜酸乳桿菌KLDS1.0901和KLDS1.1003的抑制率達到了10%及以上，抑制作用明顯，并且與參考菌株LGG無顯著差異。然而，包括參考菌株在內的所有受試菌株的CFE都沒顯示出α-葡萄糖苷酶抑制作用。田芬等[33]研究發現，77 株益生菌中僅有13 株菌的CFS對α-葡萄糖苷酶有抑制作用，所有菌株的CFE對該酶沒有抑制作用，與本研究結果一致。Zeng Zhu等[34]發現，當菌液濃度為1×1010CFU/mL時，LGG的CFS和CFE對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性，抑制率分別為28.3%和2.5%；菌株ZF06-3、IF13和IF2-17的CFS對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為34.9%、28.0%和18.7%，但是3 株菌的CFE均未表現出抑制作用，與本實驗研究結果相同。本實驗最終篩選得到的嗜酸乳桿菌KLDS1.1003的CFS的α-葡萄糖苷酶抑制活性為12.13%，該結果低于Zeng Zhu等[34]的結果，可能是由菌濃度較低導致的。此外，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003的CFS的酶抑制率與商業菌株LGG無顯著差異（P＞0.05）。目前，研究發現乳酸菌產生的胞外多糖能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性[35]。此外，有研究顯示一些小分子肽也可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性[36]。

DPP-IV抑制實驗結果顯示，11 株乳酸桿菌的CFS對DPP-IV有抑制作用，而商業菌株LGG未表現出抑制作用。除菌株KLDS1.0207外，其他菌株的CFE均表現出不同的DPP-IV抑制活性，并且有6 株乳酸菌的抑制率高達10%及以上，抑制作用明顯。此外，CFE的酶抑制率普遍高于CFS。Zeng Zhu等[34]研究發現LGG的CFS對DPPIV的抑制率為9.2%，CFE的抑制率為14.6%；其他受試菌株也都表現出不同的酶抑制活性，CFE的抑制率普遍高于CFS，這與本實驗研究結果相同。此外，進一步研究發現CFS對酸堿、溫度不敏感，但是對蛋白酶敏感，CFS經蛋白酶處理后酶抑制活性增大，說明可能是CFS中的蛋白或肽類物質發揮作用。本實驗篩選得到的最優菌株為嗜酸乳桿菌KLDS1.1003，CFS的DPP-IV抑制率為7.13%，與Zeng Zhu等[34]的結果相比其抑制率較低，這可能與菌液濃度和DPP-IV的來源有關。Lacroix等[37]比較研究了一些食源蛋白的天然肽序列對豬和人源DPP-IV的抑制特性，結果顯示，不同天然肽表現出的抑制活性在兩種酶間有顯著差異。張穎[38]研究發現合成肽對豬源DPPIV的抑制作用比對人源DPP-IV更加敏感。

為保證所選益生菌能夠有效發揮降糖作用，本研究又對酶抑制性較好的菌株進行了益生特性的評價。在酸耐受實驗中，選擇pH 2.0和pH 3.0進行了研究，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003、KLDS1.0901、KLDS1.0902和LGG在pH3.0的酸性條件下均有較高的存活率，在pH 2.0的酸性條件下孵育3 h，僅菌株KLDS1.0901能夠部分存活。Matsumoto等[39]研究發現菌株的耐酸能力大小與菌株的H＋-ATP酶活性有關。因此，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的酸耐受性很可能與該酶活性有關。在膽鹽耐受性實驗中，在0.3%膽鹽條件下，4 株菌的生長滯后時間不一，其中商業菌株LGG的膽鹽耐受性最好，滯后時間為2.06 h，其次為嗜酸乳桿菌KLDS1.1003，但二者差異不顯著（P＞0.05）。有研究報道顯示，有些乳酸菌能夠調節一些主要負責保持細胞膜完整性基因的表達，從而增強膽汁鹽耐受性[40]。此外，某些乳酸菌能夠通過膽鹽水解酶水解膽汁鹽降低膽鹽的影響[41]。在疏水性實驗中，各菌株間有所差異，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901和KLDS1.1003的疏水性明顯高于菌株LGG和KLDS1.0902。

4 結 論

本研究所篩選出的具有高α-葡萄糖苷酶和DPP-IV抑制活性的菌株為嗜酸乳桿菌KLDS1.1003、KLDS1.0901和KLDS1.0902，而它們的益生特性有所不同。主成分分析對α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制率及益生特性進行綜合評估，結果表明嗜酸乳桿菌KLDS1.1003的得分最高，具有良好的耐受性和降糖潛力。