復合乳酸菌發酵蛋殼制備乳酸鈣

黃 翔，陶 蕾，楊 燃，黃 群,*，安鳳平，黃 茜，馬美湖

（1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

我國是世界禽蛋生產和消費第一大國，每年廢棄的雞蛋殼約300萬 t[1]，造成嚴重的環境污染和資源浪費。蛋殼鈣是一種理想的膳食鈣源，提自蛋殼粉的鈣比商業碳酸鈣在大鼠小腸中更易吸收[2]。蛋殼鈣可用于人體和動物骨礦化和生長的缺鈣治療[3]，以及作為牙膏的抗牙垢劑[4]。食品工業利用蛋殼鈣制備的乳酸鈣作為固化劑、調味劑、膨松劑及抗菌劑[5]。

乳酸鈣、檸檬酸鈣和葡萄糖酸鈣等有機酸鈣制劑的高效制備為當前研究熱點[6]。乳酸鈣是補充和強化骨骼鈣的理想添加劑，廣泛用于醫藥、食品和飼料工業[7]。蛋殼含有豐富的碳酸鈣，可作為鈣源制備有機酸鈣，目前主要方法有高溫煅燒法、直接中和法與微生物發酵法[8]。高溫煅燒法和直接中和法能耗大，鈣轉化率較低，工業化生產成本高。微生物發酵法耗能低、不易對環境產生污染、制備工藝條件簡單，更適于制備乳酸鈣[9]。

微生物發酵轉化蛋殼鈣為乳酸鈣的常用微生物為乳酸菌，乳酸菌能利用糖類發酵產生乳酸[10]。復合乳酸菌可以利用不同乳酸菌的生理生化特點，互為對方提供適宜的生長環境，并達到代謝產物的互補。已有研究[11-12]使用復合菌種發酵蘋果山藥果蔬汁，發現復合菌種發酵最終產酸量和產品品質明顯要優于單一菌株，發酵能力和抑菌效果也優于單株乳酸菌。利用4 種乳酸菌復合發酵蛋殼制備乳酸鈣的研究鮮見報道，本研究選取乳酸產量相對較高的蒙氏腸球菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌4 種乳酸菌復合發酵蛋殼生物制備乳酸鈣，利用響應面法對發酵工藝進行優化，以提高轉化效益與乳酸鈣產量，為后續乳酸菌發酵法回收利用廢棄蛋殼制備乳酸鈣提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋殼收集于福建農林大學蛋糕店。蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）為華中農業大學蛋品加工國家地方工程實驗室貯藏，嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，保藏編號CICC 20382）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，保藏編號CICC 20282）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

MRS（Man Rogosa Sharpe）、MRS瓊脂培養基 青島海博生物技術有限公司；鈣黃綠素（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

YF-150B中藥材粉碎機 瑞安市永歷制藥機械有限公司；TGL-16冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司；GI65DS高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；GHP-9160隔水式恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；ZWYR-240恒溫培養振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司；AVATAR360傅里葉變換紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司；DY5261型X射線多晶衍射儀 美國CEM公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋殼粉制備

蒸餾水清洗后的蛋殼于70 ℃電熱恒溫干燥箱中干燥3 h，隨后放入連續式高性能粉碎機中粉碎。將蛋殼粉加入蒸餾水浸泡，攪拌10 min后靜置15 min，除去上液漂浮的蛋殼膜。蛋殼粉抽濾后在70 ℃干燥3 h，過200 目篩后收集備用。

1.3.2 培養基與菌種活化

發酵培養基：蛋白胨0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，酵母提取物1.0 g，鹽溶液（NaHCO310.0 g、NaCl 2.0 g、無水CaCl20.2 g，K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.48 g，定容至1 000 mL）4 mL，葡萄糖12 g，蛋殼粉8 g，蒸餾水100 mL。培養基成分充分混均后，121 ℃滅菌20 min，蛋殼粉單獨滅菌，冷卻后備用。

菌種活化：4 株菌種（蒙氏腸球菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌）分別接種于MRS液體培養基中，于37 ℃培養24 h，2.0%的接種量傳代2～3 次，直至恢復活力，0～4 ℃冰箱中低溫保藏。

1.3.3 理化指標測定

發酵液乳酸鈣含量測定：采用文獻[1 3]的方法；發酵液殘糖量測定：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[14]；乳酸鈣純度測定：參照參考文獻[15]的方法。

1.3.4 拮抗實驗

將4 種菌兩兩交叉劃線接種于MRS瓊脂培養基上，37 ℃培養24 h，觀察十字交叉處是否有被抑制而發生菌落萎縮和消失的現象[10]。

1.3.5 乳酸菌生長曲線繪制

將活化后的4 種乳酸菌按體積分數2.0%分別接種于MRS液體培養基中，37 ℃厭氧培養。前12 h每隔1 h測定一次，后12 h每隔3 h測定一次，菌液稀釋10 倍后測600 nm波長處OD值，連續測定至48 h。MRS液體培養基為空白對照，繪制乳酸菌生長曲線。

1.3.6 發酵工藝優化

1.3.6.1 復合菌種不同組合對乳酸鈣產量的影響

4 種乳酸菌按不同比例相互組合。將各菌液濃度統一調成1×108CFU/mL，發酵培養基中依次接入蒙氏腸球菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌，接種體積比為1∶1∶1∶1、1∶2∶1∶1、1∶1∶2∶1、1∶1∶1∶2、2∶1∶1∶1等15 種組合。于37 ℃、180 r/min厭氧發酵72 h，研究4 種菌不同組合發酵對乳酸鈣產量的影響。

1.3.6.2 單因素試驗

發酵溫度的選擇：培養基pH值為7.0，接種量為8.0%，分別在32、34、37、39、42 ℃，180 r/min厭氧發酵72 h，考察發酵溫度對乳酸鈣產量的影響。

發酵時間的選擇：培養基pH值為7.0，接種量為8.0%，于37 ℃、180 r/min條件下厭氧發酵48、54、60、72、80 h，考察發酵時間對乳酸鈣產量的影響。

初始pH值的選擇：調整培養基pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在接種量為8.0%的條件下，37 ℃、180 r/min厭氧發酵60 h，考察培養基pH值對乳酸鈣產量的影響。

接種量的選擇：向發酵培養基中依次接入蒙氏腸球菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌，設定各個菌株的接種量分別為2%、3%、4%、5%、6%，則復合菌總接種量分別為8.0%、12.0%、16.0%、20.0%、24.0%，接入到發酵培養基中，37 ℃、180 r/min厭氧發酵60 h，考察不同菌液接種量對乳酸鈣產量的影響。

不同金屬離子及其質量濃度的選擇：將MnSO4·H2O、ZnSO4·H2O、MgSO4·7H2O分別配制成質量濃度0.01、0.1、1.0 g/L的金屬離子溶液，分別將不同濃度的Mn2＋、Zn2＋、Mg2＋金屬離子溶液添加到發酵培養基中。在培養基pH 7.0、接種量8.0%的條件下，37 ℃、180 r/min厭氧發酵60 h，考察不同金屬離子及其質量濃度對乳酸鈣產量的影響。

1.3.6.3 響應面試驗設計

綜合考慮單因素試驗結果，選取對乳酸鈣產量影響顯著的3 個因素發酵時間、初始pH值、接種量為考察變量，乳酸鈣產量為響應值，通過響應面分析優化發酵條件。應用Design-Expert 10.0.7軟件設計3因素3水平響應面分析試驗，試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables used for response surface design

1.3.7 發酵液中乳酸鈣的提取

發酵液含有發酵產物乳酸鈣、過剩蛋殼鈣、未發酵殘糖、色素、蛋白質等[16]，需對發酵液進行除雜處理。發酵液離心后取上清液，加入氫氧化鈣調pH值至12～13，80 ℃攪拌30 min。將粗乳酸鈣液過濾，pH值調至4～5，加入3.0%～4.0%的粉末活性炭以吸附色素等雜質，50～60 ℃靜置2 h，真空抽濾濾去活性炭，重復脫色直至澄清。收集乳酸鈣母液旋轉蒸發濃縮后，低溫冷卻結晶，再將晶體溶于蒸餾水中進行重結晶。加入適量無水乙醇，洗滌乳酸鈣晶體，除去殘余的乳酸及表面附著的其它殘留物。將乳酸鈣產物于80 ℃干燥8 h，達到質量恒定即可粉碎、過篩得乳酸鈣成品[15]。

1.3.8 產物結構表征

1.3.8.1 傅里葉變換紅外光譜分析

將乳酸鈣樣品和溴化鉀粉末于120 ℃干燥4 h，干燥器中冷卻30 min。分別取乳酸鈣樣品和溴化鉀粉末以1∶100的比例置于瑪瑙研缽中充分混合，研磨精細。研磨混勻的粉末加入制樣模具中壓成幾乎呈透明的圓片后進行紅外光譜分析。測定條件：光譜范圍4 000～400 cm-1；峰-峰值的噪聲為1.3×10-5Abs/min掃描；RMS噪聲為3.6×10-6Abs/min掃描。

1.3.8.2 X射線衍射分析

將乳酸鈣樣品充分干燥后用瑪瑙研缽盡可能研細，然后把試樣粉末均勻撒入制樣框的窗口中，用玻璃片輕壓制成1.5～2.0 mm足夠緊密的平整平面，將乳酸鈣制樣框放入試樣臺進行X射線衍射分析。測定條件：電壓220 V，頻率50 Hz，連續掃描，管電流20 mA，管電壓10～40 kV，初始角度10°，終止角度80°。

1.4 數據處理

每組實驗重復3 次，采用SPSS 24.0統計軟件對數據進行單因素方差分析ANOVA及顯著性差異分析，結果以±s表示。利用Origin 2017軟件繪圖，選用Design-Expert 10.0.7 軟件進行響應面分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 拮抗實驗結果

圖1 4 種菌的拮抗實驗結果Fig. 1 Antagonistic effects among four strains

如圖1所示，平板上4 種菌均生長良好，兩兩交叉處無菌落萎縮或消失現象，說明4 種菌之間沒有拮抗作用，可以用于混菌復合發酵實驗。

2.2 乳酸菌生長曲線

圖2 乳酸菌生長曲線Fig. 2 Growth curves of lactic acid bacteria

由圖2可知，4 種乳酸菌的延滯期較短，在接種后0～4 h開始緩慢生長，該時期內細胞繁殖較慢，數量增長較少。菌體經過較短的延遲期后進入對數生長期，在4～10 h內生長迅速，呈指數級增長，菌種代謝和繁殖加快，酶系活躍，代謝旺盛，培養基內菌株生長速率達到最大。到12 h時總菌數達到較高水平并基本保持不變，進入穩定期，菌體生長速率變化幅度趨于平穩，活菌數保持相對穩定，菌落代謝產物不斷積累達到最高峰。到20 h后進入衰亡期，活菌菌體數量逐漸緩慢減少，菌種活性降低并趨于停滯。

根據4 種菌株的生長曲線綜合判斷，菌株接種后12 h活性較高，在12 h時各菌液的OD值均達到較大值，適合下一代的接種[17-18]。此后保持相對穩定，說明菌液在12 h時生長狀況最佳，故本實驗中4 種乳酸菌均選取培養12 h的穩定期菌液進行接種發酵。

2.3 復合菌株組合對乳酸鈣產量的影響

圖3 復合菌株組合對乳酸鈣產量的影響Fig. 3 Effects of different mixed starter cultures on the yield of calcium lactate

依次按照蒙氏腸球菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌的順序接種。由圖3可知，復合菌種接種量比為1∶1∶2∶1時，乳酸鈣產量最高。對結果進行的差異顯著性分析表明，接種比為1∶1∶2∶1與1∶2∶2∶1、2∶1∶1∶1無顯著差異（P＞0.05），與其他12 組均有顯著差異。有研究報道，嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌以1∶1接種的發酵活力最佳[19]。乳酸桿菌屬的干酪乳桿菌是乳酸生產的重要來源，這可能是將干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合后對其他乳酸菌起到了互相促進生長的作用[20]，達到理想的發酵效果。因此復合菌株接種量比選定為1∶1∶2∶1。

2.4 單因素試驗結果

圖4 單因素對乳酸鈣產量的影響Fig. 4 Effects of fi ve fermentation parameters on calcium lactate yield investigated by one-factor-at-a-time method

由圖4a可知，隨著發酵溫度的升高，乳酸鈣產量先升高后下降，發酵溫度對乳酸鈣產量影響顯著。37 ℃時乳酸鈣產量達最大值，殘糖量最低，說明復合乳酸菌利用葡萄糖的效果最好。當培養溫度低于37 ℃時，溫度過低，酶活性受抑制，酶促反應減弱，導致菌體生長和代謝減緩。但溫度過高時，會導致菌體蛋白質凝固變性，核酸降解變性失活[21]，故高于37 ℃后乳酸鈣產量降低。復合乳酸菌的適宜發酵溫度為37 ℃。

由圖4b可知，隨著發酵時間的延長，乳酸鈣產量逐漸升高，葡萄糖含量逐漸降低。發酵時間對乳酸鈣產量和殘糖量有顯著影響。當發酵時間超過60 h后，乳酸鈣產量增長緩慢且趨于停止。這是因為在60 h之前隨著培養時間的延長，乳酸菌數量不斷增加，利用葡萄糖發酵產生的乳酸含量也逐漸增多，葡萄糖作為乳酸菌生長發酵的碳源，生成大量的乳酸鈣。60 h后葡萄糖等營養物質含量減少，減緩了乳酸菌的生長和代謝[22]，導致乳酸鈣的產量減少。發酵時間以60～72 h為宜。

由圖4c可知，隨著培養基初始pH值的升高，乳酸鈣產量呈現先升高后降低的變化特征。初始pH值對乳酸鈣產量有顯著影響。當pH值較低時，由于大量氫離子的存在，超過了乳酸菌保持胞內pH值動態平衡的能力，導致膜脂飽和度下降，胞內pH值也隨之下降，從而抑制了乳酸菌的生長。培養基pH值控制在6.0時，乳酸菌生長較好，乳酸產量最高，這與乳酸菌生長的最適pH值一致[23]。當pH值超過6.5后，pH值升高使原來培養基中離子間的化學平衡發生移動、生成沉淀，降低了培養基的有效成份，也抑制了乳酸菌的代謝生長。發酵培養基pH值以6.0為宜。

由圖4d可知，隨著接種量的增加，乳酸鈣產量逐漸降低。這是因為接種量過多時，菌體生長過快，微生物對營養物質的競爭增強，培養液黏度增加，加速細胞衰老，導致部分菌體死亡，并且產生過多代謝廢物，葡萄糖利用降低，發酵后勁不足，從而影響代謝產物的合成，產酸量隨之下降[24]。發酵接種量以8.0%為宜。

由圖4e可知，低濃度Mn2＋與Mg2＋一定程度上可提高乳酸鈣產量，最佳質量濃度均為0.1 g/L；而高質量濃度會表現出一定的抑制作用。二價金屬離子Mn2＋、Mg2＋是激活金屬酶的必要輔因子，糖酵解途徑的大多數酶都需要Mg2＋的參與，Mg2＋含量與正常細胞的增殖直接相關；Mg2＋是葡萄糖激酶、磷酸烯醇化酶、丙酮酸酶等主要酶的激活劑和復合酶的中心組成部分，但作用濃度較低[25]。Mn2＋是乳酸脫氫酶的組成部分，也是某些磷酸轉移酶的輔因子，對細胞生長速度和生物量濃度具有重要的有益影響，可促進乳酸生成[26]。Guo Yuxing等[27]研究發現Mn2＋、Mg2＋和Ca2＋可以顯著增強乳酸菌蛋白酶活力，而Co2＋、Zn2＋、Ni2＋和EDTA則會抑制該酶活性；與本研究結果一致，但對提高乳酸鈣產量的效果不顯著。

2.5 響應面試驗結果

2.5.1 響應面回歸模型的建立與分析

以發酵時間、初始pH值和接種量為試驗因素，基于Box-Behnken試驗設計，以乳酸鈣產量為響應值，進行二次多項回歸方程擬合及分析。試驗設計及結果如表2所示。

對試驗數據進行多項式擬合回歸，得二次多元回歸方程：Y=20.47-1.09A＋1.48B-0.42C＋1.68AB-0.051AC-2.56BC＋6.07A2＋5.03B2＋6.35C2。

為進一步分析回歸方程的擬合度，對模型進行ANOVA方差分析，結果如表3所示。擬合方程的P值小于0.000 1，表明響應回歸模型達到了極顯著水平。失擬項P=0.051 0＞0.05，失擬不顯著，說明方程的擬合程度較好，回歸方程可以準確分析和預測各因素與乳酸鈣產量之間的關系。模型的確定系數R2為0.988 3，說明該模型能解釋98.83%響應值的變化，因而該模型擬合程度較好，能很好地反映響應值的變化，可以利用此模型對乳酸鈣產量進行分析和預測。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design with results for response surface analysis

表3 回歸模型和方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由回歸模型和方差分析可知，方程一次項B，交互項BC和二次項A2、B2、C2對乳酸鈣產量的影響達到極顯著水平；方程一次項A、交互項AB影響達到顯著水平。根據F值可知，各因素對乳酸鈣產量影響的大小順序為：初始pH值（B）＞發酵時間（A）＞接種量（C）。

2.5.2 響應面分析與優化

根據回歸擬合方程，每2 個因素對乳酸鈣產量作響應面和二維等高線圖（圖5）。通過觀察響應面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映因素之間交互作用對乳酸鈣產量的影響，當圖形呈橢圓形或馬鞍形時，表示兩因素交互作用顯著[28]。分析可知，發酵液pH值（B）和接種量（C）的交互作用對乳酸鈣產量的影響最為明顯。初始pH值對乳酸鈣產量影響的等高線較密集，說明發酵液初始pH值的影響更為顯著，與模型方差分析得出的結論一致。

圖5 各因素交互作用對乳酸鈣產量的影響Fig. 5 Interactive effects of variables on calcium lactate yield

2.5.3 最佳條件的預測及驗證

通過回歸模型的預測，響應值（Y）最大值時各因子水平為A=1、B=1、C=-1。對應的復合乳酸菌發酵蛋殼制備乳酸鈣最佳工藝條件為發酵溫度37 ℃、發酵時間72 h、發酵液pH 6.5、復合菌接種量8.0%，在此條件下預測乳酸鈣產量為42.030 g/L。為驗證模型預測的準確性，依據響應面試驗優化得到的發酵條件，3 次平行實驗進行驗證，在此條件下，乳酸鈣產量達（40.01±0.035）g/L，高于陳文潔等[17]報道的27.28 g/L，與模型預測值相差4.8%，與理論值基本相符，說明采用此模型優化得到的參數準確可靠。測得所制備的乳酸鈣純度為92.65%，高于李逢振等[29]報道的86.92%。

2.6 產品結構表征

2.6.1 傅里葉變換紅外光譜

圖6 蛋殼源乳酸鈣產品（A）及其紅外光譜圖（B）Fig. 6 Visual appearance (A) and infrared spectrum (B) of calcium lactate from eggshell

如圖6所示，蛋殼源乳酸鈣呈白色或乳白色晶體粉末；與蛋殼粉的紅外光譜對比可知，蛋殼鈣經發酵已轉化為乳酸鈣。在3 500～3 200 cm-1出現了一個較寬且強的吸收峰，為游離O—H的彎曲振動；濃度較高的乳酸鈣試樣中，羥基化學物產生締合現象，O—H的伸縮振動吸收峰稍微向低波數方向位移所形成的，峰尖約在3 350 cm-1左右。在3 000～2 800 cm-1范圍內出現一個小而尖的峰，這是典型的—CH3、C—H伸縮振動導致的吸收峰。而本應在1 900～1 650 cm-1范圍內出現的C＝O伸縮振動的吸收峰由于結合了Ca2＋，向低波數1 600～1 500 cm-1范圍內發生了偏移。在1 350～1 450 cm-1出現的細尖峰為C—H的彎曲振動；紅外光譜在1 300～4 000 cm-1為官能團區，小于1 300 cm-1為非官能團區，反映的是分子結構變化，如C—C的伸縮振動[30]。通過對產物乳酸鈣的紅外光譜分析，證實復合乳酸菌發酵蛋殼鈣制備所得產物為乳酸鈣。

2.6.2 X射線衍射

圖7 蛋殼乳酸鈣X-射線衍射Fig. 7 X-ray diffraction patterns of calcium lactate from eggshell

如圖7所示，蛋殼乳酸鈣的衍射峰尖銳清晰，說明乳酸鈣結晶程度較高[31]。將樣品的X-射線衍射圖譜與JCPDS標準物質卡片05-0101中不同角度位置（2θ）的乳酸鈣數據對比進行物相鑒定[32]，發現在乳酸鈣主要特征衍射峰位置（2θ為8.0°、22.1°、27.4°、45.2°等）左右均出峰，特征峰位置和標準譜圖在相同角度兩圖譜出現衍射峰相似，說明晶體及空間結構相似，再次驗證發酵產物為乳酸鈣[33]。

3 結 論

利用雞蛋殼為天然綠色鈣源通過生物發酵轉化制備乳酸鈣，采用復合乳酸菌發酵蛋殼制備乳酸鈣，單因素試驗研究了發酵溫度、初始pH值、接種量等因素對乳酸鈣產量的影響；在此基礎上根據Box-Behnken試驗設計和響應面分析對發酵條件進行優化。結果表明，復合乳酸菌發酵蛋殼制備乳酸鈣的最佳工藝條件為：發酵溫度37 ℃、發酵時間72 h、初始pH 6.5、復合菌接種量8.0%，在此條件下，乳酸鈣產量達（40.01±0.035）g/L，純度為92.65%。通過傅里葉變換紅外光譜、X-射線衍射表征了乳酸鈣的結構，證實發酵得到的產物即為乳酸鈣。此研究為進一步利用微生物發酵蛋殼制備乳酸鈣的開發利用提供了理論依據，且為雞蛋殼的綜合利用開辟了可行、有效途徑。