泡菜發酵乳酸菌的分離鑒定及耐藥性分析

黨 喬，孔令聰，劉 潔，劉樹明，魏 星，馬紅霞,*，閔偉紅,5,*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118；3.動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，吉林 長春 130118；4.遼源市動物疫病預防控制中心，吉林 遼源 136220；5.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

乳酸菌是一類可通過發酵將碳水化合物轉化為乳酸的微生物，由于其具有兼性厭氧的特性，可廣泛存在于自然界中[1]。相關研究已證明乳酸菌不但可以調節微生態平衡、抗氧化，還具有緩解乳糖不耐癥、預防腫瘤和癌癥發生等益生功能[2]，其已廣泛用于醫療、食品、工業等領域[3]。目前用于食品工業中的乳酸菌主要包括乳酸桿菌、乳酸球菌、鏈球菌、明串珠菌等[4]。

隨著國內外學者對乳酸菌研究的不斷深入，更加推動了乳酸菌制品的廣泛流行。但是由于乳酸菌缺乏嚴格的功效性和安全性認定標準，已經引發了一系列潛在的風險。其中，劣質乳酸菌可能導致耐藥基因傳播以及誘發致病菌產生耐藥性的問題，已經引發了相關學者的高度關注[5]。雖然乳酸菌在食品發酵、青貯飼料等領域具有悠久的歷史[6]，但研究發現，有些乳酸菌不但對臨床常用藥物產生了抗藥性，還有可能將其攜帶的耐藥基因通過食物鏈傳遞給其他腸道及呼吸道致病菌，并賦予其耐藥性[7]。

泡菜是以蔬菜為原料通過乳酸菌發酵制得的傳統食品[8]，因其具有獨特的口感、高營養價值和易于儲存的優點，深受人們喜愛。但其在食用之前并不經過滅菌處理，造成大量的乳酸菌進入人體[9]。因此，亟需對市售的泡菜發酵菌種進行分離鑒定，并對其耐藥性進行檢測，以期為乳酸菌安全性評估和泡菜質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

樣品為吉林地區朝鮮族自制泡菜；細菌DNA基因組抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 培養基

MRS固體培養基、MRS液體培養基、Mueller-Hinton Broth（M-H肉湯）、Mueller-Hinton Agar（M-H瓊脂）青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 抗生素

氨芐西林、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素、四環素 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；環丙沙星、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢呋辛、克林霉素中國獸醫藥品監察所；鏈霉素、環丙沙星、左氧氟沙星上海易恩化學技術有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫空氣浴搖床 常州國旺儀器制造有限公司；超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；數顯恒溫水浴鍋 丹陽門石英玻璃場；微量分光光度計 美國Thermo公司；超低溫冰箱 中國海爾集團；瓊脂糖凝膠電泳儀 北京市六一儀器廠；旋渦混合器 海門市麒麟醫用儀器場。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分離純化

將采集到的泡菜汁置于無菌超凈工作臺中，使用生理鹽水，將樣品10 倍梯度稀釋，分別取10-5、10-6、10-7三個梯度的稀釋液100 μL均勻涂布在含有2%碳酸鈣的MRS培養基上，將涂布好的培養基置于厭氧罐中，37 ℃培養48 h。挑取有明顯溶鈣環的不同形態菌落接種在相應的液體培養基中增菌培養24 h，再次劃線接種在MRS固體培養基上，經分離純化3 次后，挑取單個菌落，進行過氧化氫酶實驗和革蘭氏染色。將革蘭氏染色為陽性，過氧化氫實驗為陰性的菌落增菌培養，在MRS液體培養基（含20%甘油）中-80 ℃保存。所有菌株在使用前都經過3 次傳代培養。

1.3.2 乳酸菌16S rDNA基因測序鑒定1.3.2.1 乳酸菌DNA的提取

使用生工生物工程（上海）股份有限公司細菌DNA基因組抽提試劑盒提取分離菌株的基因組。

1.3.2.2 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增乳酸菌16S rDNA基因序列

使用16S rDNA通用引物，正向序列：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；反向序列：1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。PCR體系為50 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，DNA模板4 μL，引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，加水補充至50 μL。

PCR擴增程序設置如下，預變性：94 ℃、5 min；變性：94 ℃、30 s；退火：55 ℃、30 s；延伸：72 ℃、90 s；30 個循環；末端延伸：72 ℃、10 min。

1.3.2.3 PCR擴增產物檢測及測序

取2.5 μL PCR擴增產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在1 500 bp處有清晰條帶的樣品送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析。將得到的測序結果采用BLAST與NCBI中的數據進行比對確定其屬種。

1.3.3 抗生素敏感性實驗

參照臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的瓊脂稀釋法測定所分離乳酸菌對10 種抗生素的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。采用二倍稀釋法，制備抗生素質量濃度為512～0.031 25 μg/mL且加入5%血清的MH瓊脂固體平板。所有待測菌株濃度調整為1×106CFU/mL，使用多點接種儀接種于含有不同抗生素的瓊脂培養基上，37 ℃中培養24 h。使用大腸埃希氏菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質控株，每批實驗均使用質控株作為對照，并要求質控株MIC在CLSI規定范圍內。使用不加抗生素的瓊脂平板作為空白對照。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌序列同源性比對結果

從1 5 份樣品中共分離出3 4 株乳酸菌，經16S rDNA測序分析，其分別屬于3 個屬13 種。分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）12 株，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）3 株，彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）1 株，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）2 株，棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）1 株，短乳桿菌（Lactobacillus. brevis）5 株，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）1 株，清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）2 株，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）2 株，嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）2 株，食竇魏斯氏乳桿菌（Weissella crbaria）1 株，堅強腸球菌（Enterococcus durans）1 株，Lactobacillus namurensis1 株。16S rDNA測序結果經NCBI BLAST比對結果如表1所示。結果表明泡菜中乳酸菌種類繁多，植物乳桿菌是本次采集的泡菜樣品中的優勢菌株。

表1 乳酸菌16S rDNA序列同源性比對結果Table 1 Homologous analysis of lactic acid bacteria by 16S rDNA sequencing

2.2 乳酸菌對抗生素敏感性實驗

采用瓊脂稀釋法檢測從泡菜中分離到的34 株乳酸菌對氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、氯霉素、紅霉素、克林霉素、四環素、左氧氟沙星、環丙沙星的敏感性。被測菌株的MIC如表2所示，藥物敏感性判斷標準參照歐洲食品安全管理局（European Food Safety Authority，EFSA）[10]和Wang Jing等[11]。

表2 乳酸菌對10 種抗生素的MIC檢測結果Table 2 Minimum inhibitory concentrations of lactobacilli when exposed to ten antibiotics

結果表明，分離得到的34 株乳酸菌均表現出不同程度的耐藥性。對環丙沙星（85.29%，29/34），左氧氟沙星（61.76%，21/34），卡那霉素（52.94%，18/34），鏈霉素（50%，17/34），慶大霉素（29.41%，10/34），克林霉素（38.23%，13/34），紅霉素（20.5%，7/34），四環素（20.5%，7/34）均表現出不同的耐藥性。對氨芐青霉素和氯霉素全部敏感，對氨芐青霉素MIC不大于2 μg/mL，對氯霉素MIC不大于4 μg/mL。所測菌株對抗生素的耐藥情況為環丙沙星＞左氧氟沙星＞卡那霉素＞鏈霉素＞克林霉素＞慶大霉素＞紅霉素＞四環素＞氯霉素=氨芐青霉素。

2.3 乳酸菌多重耐藥性分析

大多數的乳酸菌都表現為多重耐藥，只有1 株鼠李糖乳桿菌和1 株腸膜明串珠菌對單一抗生素耐藥，其余菌株均對多種抗生素耐藥。5 株乳酸菌對2 種抗生素耐藥，7 株乳酸菌對3 種抗生素耐藥，12 株乳酸菌對4 種抗生素耐藥，4 株乳酸菌對5 種抗生素耐藥，1 株乳酸菌對6 種抗生素耐藥，乳酸菌耐藥表型分析如表3所示。乳酸菌多重耐藥性存在個體間差異，大多數乳酸菌均對環丙沙星、左氧氟沙星、鏈霉素耐藥。

表3 乳酸菌多重耐藥性Table 3 Multiple drug resistance of lactobacilli

2.4 不同菌種耐藥情況分析

本實驗分離出植物乳桿菌數量最多為12 株，除6-1外，其余植物乳桿菌均對環丙沙星耐藥，5 株對左氧氟沙星和慶大霉素耐藥，9 株對鏈霉素耐藥，3 株對克林霉素耐藥，6 株對卡那霉素和紅霉素耐藥。分離得到短乳桿菌5 株，全部對環丙沙星和左氧氟沙星耐藥，30-1對四環素和紅霉素耐藥，27-1-2對四環素耐藥，26-2對卡那霉素耐藥，25-3對慶大霉素和鏈霉素耐藥，28-2對紅霉素和克林霉素耐藥。2 株鼠李糖乳桿菌耐藥性較低，僅對卡那霉素和左氧氟沙星耐藥。腸膜明串珠菌1-1僅對環丙沙星耐藥，P2對四環素、慶大霉素、左氧氟沙星、環丙沙星耐藥。干酪乳桿菌28-4和Z3均對卡那霉素和左氧氟沙星耐藥。2 株清酒乳桿菌耐藥譜相同，均對克林霉素、鏈霉素、慶大霉素、左氧氟沙星耐藥。2株嗜熱鏈球菌和兩株干酪乳桿菌耐藥譜差異均較大。棒狀乳桿菌5-5、嗜酸乳桿菌4-1、堅強腸球菌32-1均對克林霉素、左氧氟沙星、環丙沙星耐藥，但也存在對其他抗生素耐藥性差異。

3 討 論

3.1 泡菜中乳酸菌分離鑒定

泡菜是以新鮮蔬菜為原料，加入一定量的食鹽，在乳酸菌和酵母等微生物的厭氧發酵下，形成的有獨特口感的發酵食品[12]。國內外多名學者均從泡菜中分離得到大量乳酸菌。Xiong Tao[13]和鄧維琴[14]等研究表明泡菜發酵過程中優勢乳酸菌主要包括Lactobacillus pentosus、L. plantarum、L. brevis、Lactobacillus citreum和Leuconostoc mesenteroidessubsp.。孟令帥等[15]以沈陽地區泡菜為原料，從中分離得到2 個屬6 種乳酸菌。本實驗以吉林地區傳統朝族泡菜為材料，分離得到3 個屬13 種乳酸菌，共計34 株。與上述報道略有差異，沒有分離得到L. pentosus和L. citreum，但是得到了泡菜中較為不常見的W. crbaria、E. durans和L. namurensis。這一差異結果可能與吉林地區特有的地理及氣候條件有關，不同環境中微生物種類和生物學特性有明顯差異，因此導致吉林地區泡菜中優勢乳酸菌有獨特的地域特性，并且各家庭制作泡菜所用原料、制作工藝、溫度、時間存在差異，導致不同地區樣品中乳酸菌種類不同。本實驗探究了吉林地區泡菜中乳酸菌種類及優勢菌株，為吉林地區泡菜乳酸菌多樣性研究提供了參考，也為篩選出優良的泡菜發酵乳酸菌奠定了基礎。

3.2 乳酸菌耐藥性

從吉林地區泡菜中分離得到34 株乳酸菌，采用瓊脂稀釋法檢測了10 種臨床常用抗生素的藥物敏感性，結果顯示34 株乳酸菌對環丙沙星、左氧氟沙星、卡那霉素、鏈霉素耐藥率較高，對慶大霉素、克林霉素、紅霉素、四環素等均呈現不同程度的耐藥性，分離菌僅對氨芐西林和氯霉素全部敏感。大量研究表明，乳酸菌通常對抑制蛋白質合成的抗生素敏感，如氯霉素、紅霉素、克林霉素和四環素，也對細胞壁合成抑制劑如β-內酰胺類抗生素敏感[16-18]。但乳桿菌對大多數核酸抑制劑，如環丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星等以及氨基糖苷類抗生素，如鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素等通常具有耐藥性[19-20]。其耐藥機制主要受乳酸菌存在的藥物外排系統、甲基轉移酶以及產生的藥物滅活酶所介導[21-22]。本次實驗結果與之前相關學者報道較一致[11,23-25]。但是Zhou[26]和張宏梅[27]等的藥敏結果顯示，受試乳酸菌對氨芐西林耐藥率較高，凡琴[28]、Moschetti[29]等發現所檢測的乳酸菌對慶大霉素較敏感。其不同的藥物敏感性結果可能與不同地區、不同環境中微生物面臨和承受的抗生素污染狀況不同有關，因此，不同地區、不同來源的乳酸菌應進行單獨分析。

總之，蔬菜通常被認為是綠色安全食品，泡菜一般由蔬菜表面附著的乳酸菌發酵而成，很少會單獨添加乳酸菌制劑。由于抗生素的長期使用和過度使用，環境中抗生素污染日益嚴重，且蔬菜在培育過程中受到化肥、澆灌用水、土壤等中的抗生素污染，導致了蔬菜表面的微生物產生了巨大的選擇壓力[30]。尤其在泡菜的制作過程中一般不會加入特定的乳酸發酵劑，僅由蔬菜表面的乳酸菌群發酵而成，使得耐藥性乳酸菌隨食物鏈進入人體，對人體健康造成潛在危害。因此，本實驗對泡菜中乳酸菌耐藥情況進行分析，對環境中乳酸菌的安全性評估，及具有優良風味的安全乳酸菌發酵劑的篩選具有重要意義。

4 結 論

本實驗從吉林地區泡菜中分離得到34 株優勢乳酸菌，其中包括3 個屬13 種。經藥物敏感性實驗發現所分離菌株對臨床使用較高的藥物呈現不同的耐藥性。因此，應規范泡菜發酵菌種的使用，建立菌種質量規范，以減少其耐藥基因的水平傳播給食品安全造成的風險。