產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的篩選及其發(fā)酵對(duì)豆粕的影響

鄭 麗，李 達(dá)，牛紅紅，苗欣宇，王景會(huì)*，蘇 穎*

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033）

豆粕是大豆提取完油脂之后的副產(chǎn)物，其蛋白含量高、氨基酸種類均衡，因此在食品和飼料工業(yè)中常作為廉價(jià)的優(yōu)質(zhì)蛋白原料使用[1-2]。但是，豆粕中含有的一系列抗?fàn)I養(yǎng)因子過(guò)敏性蛋白、植酸和胰蛋白酶抑制劑等限制了豆粕的使用范圍[3]。通過(guò)發(fā)酵可以有效降解這些不良因子并提高豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4]。應(yīng)用于豆粕發(fā)酵的微生物種類繁多，并且不同微生物發(fā)酵的豆粕具有不同的特性[5]。近期利用芽孢桿菌生產(chǎn)發(fā)酵豆粕成為研究趨勢(shì)。芽孢桿菌生長(zhǎng)周期短、成本低廉，并且其發(fā)酵的豆粕產(chǎn)品具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、抗?fàn)I養(yǎng)因子低等優(yōu)點(diǎn)[6]。

芽孢桿菌在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生堿性蛋白酶，蛋白酶對(duì)豆粕大分子蛋白進(jìn)行分解，產(chǎn)生小分子蛋白質(zhì)、肽和氨基酸，首先會(huì)導(dǎo)致豆粕pH值稍微下降，然后隨著發(fā)酵的進(jìn)一步加深，蛋白酶繼續(xù)水解蛋白質(zhì)片段變成氨，最終導(dǎo)致豆粕pH值上升[7]。因此，在發(fā)酵過(guò)程中，豆粕中的大分子過(guò)敏源大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白在不同的階段降解成不同種類的小分子物質(zhì)。有研究表明，在已知芽孢桿菌最佳生長(zhǎng)溫度的情況下，發(fā)酵時(shí)間對(duì)豆粕的質(zhì)量有非常重要的作用。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，豆粕中的過(guò)敏源分解不完全，不利于消化和吸收，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的過(guò)度分解，并產(chǎn)生刺鼻的氣味，不僅會(huì)降低總蛋白含量，也會(huì)影響豆粕的品質(zhì)[8]。

豆粕加工過(guò)程中蛋白成分的變化成為研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。Seo等[9]使用雙向電泳技術(shù)檢測(cè)了枯草芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中蛋白亞組分的變化；Yang Yong等[10]使用傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)了5 種豆粕蛋白水解后的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。但是，芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中豆粕蛋白的微觀結(jié)構(gòu)變化研究相對(duì)較少。有研究表明蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和消化性相關(guān)，如Peng Quanhui等[11]觀察到豆粕蛋白的分子結(jié)構(gòu)會(huì)影響其溶解性和腸道消化性。因此，研究大豆的微觀結(jié)構(gòu)可以更好地了解其營(yíng)養(yǎng)功能。

本研究篩選到1 株高產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定，以及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果顯示其是1 株暹羅芽孢桿菌。研究芽孢桿菌發(fā)酵對(duì)豆粕化學(xué)成分的變化以及對(duì)豆粕蛋白的微觀結(jié)構(gòu)影響，本實(shí)驗(yàn)可為進(jìn)一步研究微生物發(fā)酵對(duì)豆粕蛋白結(jié)構(gòu)影響提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

脫脂豆粕 吉林華展生物工程有限責(zé)任公司；脫脂乳粉 新西蘭恒天然集團(tuán)。

改良LB液體培養(yǎng)基：酵母浸粉3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、葡萄糖3 g/L，121 ℃高壓滅菌20 min。改良LB固體培養(yǎng)基：改良LB液體培養(yǎng)基添加16 g/L瓊脂粉。豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g豆粕（過(guò)20 目篩）、0.2 g紅糖、10 g蒸餾水，攪拌均勻，115 ℃高壓滅菌15 min。脫脂乳固態(tài)培養(yǎng)基：脫脂乳粉50 g/L、瓊脂粉1.5 g/L，115 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；Cary 300紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RC冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；JSM-6700F掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM） 日本JEOL公司；D/max 2550 X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 日本Rigaku公司；2300k凱氏定氮儀 丹麥Foss公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選

初篩：挑取活化后的芽孢桿菌單菌落接種于液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)菌液在4 ℃、8 000 r/min離心15 min后，取上清液過(guò)0.22 μL無(wú)菌濾膜。在脫脂乳固體培養(yǎng)基表面擺放牛津杯（直徑6 mm），使牛津杯與培養(yǎng)基接觸面無(wú)縫隙，然后在牛津杯中注入200 μL濾液。將脫脂乳培養(yǎng)基放置于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量水解圈的大小。

復(fù)篩：將初篩時(shí)具有較大水解圈的芽孢桿菌分別接種10%（加入液體培養(yǎng)基的體積為豆粕質(zhì)量的10%，活菌數(shù)約為108CFU/mL）于豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。使用60 mL、50 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液提取酶液。將培養(yǎng)基和緩沖液混合后室溫條件下振蕩30 min，繼續(xù)放置在4 ℃靜置2 h，8 000 r/min離心15 min，取上清液。蛋白酶活力檢測(cè)：參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》[12]。

1.3.2 產(chǎn)蛋白酶菌株的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)觀察

將產(chǎn)蛋白酶的菌株在改良LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，并在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況，將菌體進(jìn)行結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.3.2.2 生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)[13-14]方法，檢測(cè)菌株的性質(zhì)，包括各種糖發(fā)酵、V-P反應(yīng)、接觸酶實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.3 16S rDNA序列擴(kuò)增與鑒定

參考騰軍偉等[15]的方法。使用DNA提取試劑盒提取DNA，引物設(shè)計(jì)和PCR體系如下：正向引物27F（5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’），反向引物1492R（5’-TAGGGTTACCTTACGACTT-3’）。50 μL反應(yīng)體系為：上游引物與下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，按照PCR試劑盒添加反應(yīng)溶劑10.5 μL，最后加入超純水36.5 μL。反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃末端延伸8 min，4 ℃保存。將目的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。在EzBioCloud（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify）中選取菌株與目的菌株使用MEGA5.0制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 豆粕發(fā)酵時(shí)間對(duì)豆粕成分的影響

1.3.3.1 豆粕發(fā)酵

豆粕過(guò)20 目篩，加入與豆粕質(zhì)量相同量的無(wú)菌水和其質(zhì)量1%的紅糖。接種10 mL/100 g（加入液體培養(yǎng)基的體積與豆粕質(zhì)量比例，活菌數(shù)約為108CFU/mL）振蕩培養(yǎng)16 h的芽孢桿菌菌液，將混合物覆蓋兩層濕紗布，放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h。每12 h取樣檢測(cè)成分變化。發(fā)酵結(jié)束后，將樣品在陰涼通風(fēng)處干燥，并在-20 ℃冷柜中貯存?zhèn)溆肹16]。

1.3.3.2 芽孢隨時(shí)間的生長(zhǎng)變化

取1 g發(fā)酵完的樣品，加入生理鹽水，80 ℃保溫20 min殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定芽孢數(shù)。

1.3.3.3 可溶性還原糖檢測(cè)

采用3,5-二硝基水楊酸法[17]。

1.3.3.4 粗蛋白檢測(cè)

參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的檢測(cè)》[18]。

1.3.3.5 可溶性蛋白檢測(cè)

采用Bi Hua等[19]方法，檢測(cè)方法與粗蛋白檢測(cè)條件一致。

1.3.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢測(cè)致敏蛋白分解

電泳用蛋白提取采取Song等[20]方法，電泳分析采用Teng Da等[21]方法。

1.3.4 豆粕蛋白提取

參考Molina等[22]的方法。發(fā)酵豆粕粉碎過(guò)60 目篩，取25 g樣品加入200 mL純凈水，取1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 8.0，靜置1 h，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，將沉淀溶入8 倍體積水中，使用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 4.5，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，溶解沉淀，將溶液pH值調(diào)至中性，冷凍干燥。

1.3.5 SEM檢測(cè)

參考劉建華等[23]的方法。樣品采用離子噴金進(jìn)行檢測(cè)，加速電壓為5 kV。

1.3.6 豆粕蛋白XRD檢測(cè)

參考Zhao Xiaoyan等[24]的方法。試樣用XRD儀檢測(cè)，入射波長(zhǎng)0.154 8 nm，銅靶。儀器檢測(cè)設(shè)定：管壓50 kV，管流20 mA，掃描區(qū)域5°～40°，連續(xù)掃描。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS軟件分析，所有數(shù)據(jù)結(jié)果表示為。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

2.1.1 初篩

豆粕發(fā)酵過(guò)程中蛋白水解是主要的生化反應(yīng)過(guò)程，并且豆粕蛋白營(yíng)養(yǎng)的提高程度與蛋白酶活力呈正相關(guān)[25]，所以篩選高產(chǎn)蛋白酶的菌株對(duì)發(fā)酵結(jié)果有重要影響。實(shí)驗(yàn)室保存的51 株芽孢桿菌中，有34 株分離于遼寧省的稻草中，17 株分離于吉林省的豬飼料中。本實(shí)驗(yàn)采用脫脂乳平板測(cè)定蛋白酶水解活力，由于所有菌株在脫脂乳平板上生長(zhǎng)擴(kuò)散嚴(yán)重，所以選擇采用牛津杯法初步檢測(cè)菌株的蛋白酶活力。選擇其中13 株菌液產(chǎn)生的水解圈直徑在15 mm以上的芽孢桿菌用于復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 復(fù)篩

有研究[26]表明在篩選芽孢桿菌的過(guò)程中，由于底物的不同，芽孢桿菌生長(zhǎng)狀態(tài)不同，導(dǎo)致其對(duì)不同底物中不同種類蛋白質(zhì)分解效率不同。文獻(xiàn)指出在脫脂乳平板上水解圈較小的芽孢桿菌在豆粕培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，可以產(chǎn)生高活性蛋白酶。因此，本實(shí)驗(yàn)中脫脂乳平板水解圈與蛋白酶活力數(shù)值由于在不同底物培養(yǎng)基中測(cè)定，并不完全呈正相關(guān)。從表1可知，菌株JL8在豆粕為底物的培養(yǎng)基中產(chǎn)蛋白酶活力最高，24 h蛋白酶產(chǎn)量可達(dá)（519.1±4.7）U/g，因此JL8被選擇作為豆粕發(fā)酵菌株，對(duì)其進(jìn)行深入研究。

表1 13 株芽孢桿菌的蛋白酶水解圈直徑和蛋白酶活力Table 1 Qualitative and quantitative determination of protease produced by 13 Bacillus strains

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將JL8在固體LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h后，其菌落為乳白色，邊緣不整齊，表面粗糙，中央凸起，會(huì)分泌黏液。通過(guò)結(jié)晶紫染色、革蘭氏染色、芽孢染色、穿刺實(shí)驗(yàn)顯示，JL8為需氧菌、革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，產(chǎn)芽孢。圖1為JL8的菌落照片和顯微鏡觀察的結(jié)晶紫染色圖片。

圖1 JL8菌落形態(tài)（A）和菌體顯微鏡照片（B）Fig. 1 Colony morphology (A) and micrograph of strain JL8 (B)

2.2.2 生理生化鑒定

如表2所示，JL8更接近暹羅芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌[15,27]。

表2 JL8的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of JL8

2.2.3 菌株JL8的分子生物學(xué)鑒定

菌株JL8的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。根據(jù)1%瓊脂糖凝膠的電泳結(jié)果，在分子質(zhì)量約為1 500 bp處有特異性條帶，與預(yù)計(jì)結(jié)果相同。使用生工試劑盒回收電泳產(chǎn)物，并送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行產(chǎn)物堿基序列分析，結(jié)果表明JL8的16S rRNA序列長(zhǎng)度為1 451 bp。將所得序列上傳至EzBioClous的分析系統(tǒng)（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示JL8與1 株暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensisXY18T）的同源性達(dá)到99.14%。在基因庫(kù)中選取10 株與JL8同源性較高的菌株，使用MEG 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。發(fā)育樹(shù)顯示JL8與B. siamensisXY18T在同一個(gè)分支上[28-29]。結(jié)合上述形態(tài)學(xué)和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可將菌株確定為暹羅芽孢桿菌，并命名為B. siamensisJL8。

圖2 菌株JL8的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳Fig. 2 Electrophoresis pattern of PCR amplified product of 16S rDNA from strain JL8

圖3 根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)豆粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.3.1 發(fā)酵菌株芽孢數(shù)分析

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)芽孢桿菌數(shù)量及豆粕成分的影響Fig. 4 Effects of fermentation time on spore quantity of JL8 and chemical composition of soybean meal

如圖4A可知，JL8芽孢數(shù)從發(fā)酵開(kāi)始到24 h迅速增長(zhǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在發(fā)酵24 h后芽孢數(shù)量無(wú)明顯變化進(jìn)入穩(wěn)定期，并一直持續(xù)到發(fā)酵結(jié)束，芽孢數(shù)沒(méi)有明顯減少，可知整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中芽孢桿菌沒(méi)有進(jìn)入衰亡期。

2.3.2 豆粕可溶性還原糖含量分析

根據(jù)圖4B可知，未發(fā)酵的豆粕中可溶性還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為（1.14±0.04）%，發(fā)酵開(kāi)始時(shí)至36 h可溶性還原糖的含量小幅度上升，在發(fā)酵36 h質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值（1.99±0.02）%。然后含量開(kāi)始迅速下降，幾乎恢復(fù)到與未發(fā)酵豆粕一致，可能由于芽孢桿菌大量繁殖消耗導(dǎo)致這一現(xiàn)象。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，可溶性還原糖的含量變化并不顯著，也可能由菌株生長(zhǎng)過(guò)程中的消耗所致。

2.3.3 豆粕總蛋白含量分析

從圖4C可以看出，豆粕總蛋白含量較高，未發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（41.24±0.84）%，隨著發(fā)酵進(jìn)行總蛋白含量逐漸上升，在24 h到最大值（46.69±0.24）%，此后基本穩(wěn)定，但是在48 h后蛋白含量逐漸下降。這是因?yàn)椋谘挎邨U菌發(fā)酵過(guò)程中會(huì)將蛋白質(zhì)分解成氨氮并產(chǎn)生氨氣[30]，發(fā)酵過(guò)度的豆粕不但會(huì)產(chǎn)生刺鼻的氣味，還會(huì)降低豆粕的營(yíng)養(yǎng)成分。

2.3.4 豆粕可溶性蛋白占總蛋白含量分析

如圖4D所示，未發(fā)酵的豆粕中可溶性蛋白只占總蛋白的（0.77±0.02）%，但是在JL8產(chǎn)生的蛋白酶作用下，可溶性蛋白的含量大幅度上升，在發(fā)酵48 h質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值（15.03±0.02）%，含量幾乎為未發(fā)酵豆粕的20 倍。同時(shí)，也可看出48 h后可溶性蛋白含量大幅度下降，這與蛋白酶過(guò)度水解有關(guān)。另外，從圖4D可看出，發(fā)酵24～48 h過(guò)程中可溶性蛋白含量差別較小，因此，24 h結(jié)束發(fā)酵對(duì)可溶性蛋白含量影響不大。

2.3.5 SDS-PAGE檢測(cè)過(guò)敏蛋白

SDS-PAGE通常用于檢測(cè)大豆蛋白中的過(guò)敏蛋白組分：大豆球蛋白和β-大豆伴球蛋白。從圖5可以看出，通過(guò)24 h發(fā)酵除了20 ku處的堿性亞基，幾乎所有大分子蛋白都被蛋白酶降解成小分子產(chǎn)物，降低了豆粕蛋白的過(guò)敏源，同時(shí)也提高了蛋白的消化性，因?yàn)樾》肿拥鞍赘菀妆蝗嘶騽?dòng)物消化吸收。并且延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)24 h并沒(méi)有進(jìn)一步分解大分子蛋白，因此24 h發(fā)酵已經(jīng)充分降解了過(guò)敏源。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間豆粕蛋白成分分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of protein profile of soybean meal at different fermentation times

2.4 發(fā)酵豆粕蛋白的微觀結(jié)構(gòu)

圖6 豆粕蛋白與發(fā)酵豆粕蛋白SEM圖Fig. 6 SEM photos of native and fermented soybean meal protein

從圖6可以看出，發(fā)酵豆粕蛋白與未發(fā)酵豆粕蛋白相比具有更加疏松的結(jié)構(gòu)。在放大200 倍的情況下，可以看出未發(fā)酵豆粕呈更大的片狀結(jié)構(gòu)相對(duì)更加致密，而發(fā)酵豆粕呈破碎的小片結(jié)構(gòu)，有些結(jié)構(gòu)在蛋白酶的作用下已經(jīng)出現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步放大2 000 倍后，可以看出未發(fā)酵豆粕只能觀察到非常大的片狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，而發(fā)酵豆粕依舊可以觀察到破碎的不規(guī)則結(jié)構(gòu)——被蛋白酶分解過(guò)的蛋白碎片。SEM圖片反映出JL8菌株蛋白酶對(duì)豆粕蛋白的作用效果非常明顯，破壞了蛋白相對(duì)完整的空間結(jié)構(gòu)。并且疏松的蛋白結(jié)構(gòu)更加有利于消化和吸收，同時(shí)也提高了豆粕的營(yíng)養(yǎng)性。

2.5 蛋白結(jié)構(gòu)的XRD分析

圖7 豆粕蛋白與發(fā)酵豆粕蛋白XRD圖Fig. 7 X-ray diffraction patterns of native and fermented soybean meal protein

如圖7所示，兩種豆粕蛋白都存在兩個(gè)2θ峰值，并且都處于2θ約為20°附近，但是強(qiáng)度明顯不同，發(fā)酵豆粕的2θ角約為20.2°，強(qiáng)度為268，而未發(fā)酵豆粕的2θ角為20.7°強(qiáng)度為177，另外，在2θ角為9.2°處發(fā)酵豆粕產(chǎn)生一個(gè)強(qiáng)度為106的小峰，而未發(fā)酵豆粕的小峰為63。未發(fā)酵豆粕蛋白XRD結(jié)果與張娜等[31]的檢測(cè)結(jié)果基本一致。而圖中不同的峰距和不同的強(qiáng)度值，均反映芽孢桿菌分泌的蛋白酶改變了豆粕蛋白的主鏈結(jié)構(gòu)。Zhao Xiaoyan等[24]認(rèn)為豆粕蛋白2θ角的吸收峰強(qiáng)度和位置可能會(huì)反映出蛋白結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)的變化，圖中2θ角在20°的峰值可以反映出β-折疊結(jié)構(gòu)在整個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占的比例，本研究結(jié)果中XRD圖譜的兩種豆粕蛋白的吸收峰有顯著差異，發(fā)酵的后β-折疊結(jié)構(gòu)的峰強(qiáng)度顯著增加，說(shuō)明發(fā)酵豆粕中的β-折疊結(jié)構(gòu)含量明顯增加。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)分離、鑒定發(fā)現(xiàn)1 株高產(chǎn)蛋白酶的菌株暹羅芽孢桿菌JL8，本研究對(duì)發(fā)酵大豆制品生產(chǎn)過(guò)程中蛋白的變化分析提供了重要的理論依據(jù)，并且證明了JL8具有潛在的工業(yè)生產(chǎn)可能性。國(guó)際范圍內(nèi)，尤其亞洲國(guó)家對(duì)大豆發(fā)酵制品非常青睞，由于其可以降血壓、降血脂促進(jìn)人體健康，越來(lái)越多人喜歡食用發(fā)酵豆制品，例如日本的納豆、韓國(guó)的豆醬以及泰國(guó)的Thua-nao[8,30,32]等。國(guó)內(nèi)外的多項(xiàng)研究表明這些發(fā)酵豆制品可以提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分，將大豆中不易消化的大分子蛋白和碳水化合物，分解成人體易于吸收的多肽和可溶性糖[7]。同時(shí)，本研究獲得的高產(chǎn)蛋白酶菌JL8為暹羅芽孢桿菌，雖然國(guó)內(nèi)外有大量研究使用芽孢桿菌發(fā)酵豆粕或其他大豆產(chǎn)品，但是多為枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌[31,33]，近期Kostyleva等[34]使用γ-射線人工誘變出可以用于分解大豆蛋白的地衣芽孢桿菌，但是其他芽孢桿菌用于大豆發(fā)酵的研究相對(duì)較少，本研究為篩選更多種類的芽孢桿菌用于發(fā)酵大豆制品提供了理論支持。

通過(guò)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間豆粕產(chǎn)品的成分變化可以得出結(jié)論：24 h發(fā)酵的豆粕中的大分子過(guò)敏性蛋白已經(jīng)充分降解，即使延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間也不會(huì)使其進(jìn)一步降解，并且總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在24 h達(dá)到最大值（46.69±0.24）%。雖然根據(jù)可溶性蛋白和可溶性還原糖的檢測(cè)結(jié)果，24 h均不是其最大值，但是其24 h值與其最大值差異并不顯著，例如：可溶性還原糖24 h質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.96±0.03）%，36 h質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.99±0.02）%，幾乎相同。因此，從生產(chǎn)角度上看發(fā)酵24 h可以充分達(dá)到發(fā)酵目的，并且過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵會(huì)增加生產(chǎn)成本，也可能導(dǎo)致蛋白過(guò)度水解而產(chǎn)生的產(chǎn)品質(zhì)量下降等問(wèn)題。

Zheng Li等[16]通過(guò)使用暹羅芽孢桿菌JL8在與本研究相同條件下發(fā)酵豆粕，結(jié)果顯示大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制劑等蛋白類過(guò)敏源均顯著下降，降低幅度分別為86.0%、70.3%和95.0%。總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)從（41.84%±0.84）%顯著上升至（46.69±0.24）%。同時(shí)，豆粕的體外消化率提高了8.7%，其中大豆球蛋白和β-大豆球蛋白含量檢測(cè)與本實(shí)驗(yàn)中SDS-PAGE分析結(jié)果基本一致。這些結(jié)果均可以反映出豆粕發(fā)酵后影響性有所提高。

最后，通過(guò)對(duì)24 h發(fā)酵豆粕的SEM圖譜分析，可以得出發(fā)酵已經(jīng)改變了豆粕蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，并且SEM結(jié)果顯示蛋白質(zhì)具有更加疏松的結(jié)構(gòu)，蛋白顆粒更加小。有研究表明，小顆粒的蛋白具有更高的溶解性，可能更有利于人類或者動(dòng)物的吸收[35]。崔素萍等[36]通過(guò)利用紅外光譜分析脫脂豆腐粉蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白中二級(jí)結(jié)構(gòu)主要的類型為β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲，并且這兩者的含量多少?zèng)Q定大豆蛋白的溶解性高低。本實(shí)驗(yàn)XRD圖反映出發(fā)酵可以顯著提高豆粕蛋白中的β-折疊結(jié)構(gòu)，可能對(duì)提高大豆蛋白的溶解性有一定促進(jìn)作用。

本研究使用的暹羅芽孢桿菌具有發(fā)酵周期短、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此，具備產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的潛在優(yōu)勢(shì)。