選擇性修飾MCM-41固定化脂肪酶及其催化合成甾醇酯的應用

張 欣，陳書曼，吳 楠，王 彤，裴興武，江連洲，韓翠萍*，于殿宇*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

植物甾醇由于具有高熔點和低溶解性的物理性質而使其作為食品添加劑的使用受到限制。但是，將植物甾醇與脂類底物反應生成植物甾醇酯，可以方便地添加到食品原料中，因為植物甾醇酯的脂溶性更好[1]。目前，許多國家將植物甾醇酯添加到各類食品中以增加食品的功能性，在國內也被作為新資源食品[2-3]。植物甾醇酯可以由植物甾醇和大豆油通過酯交換反應生成。目前，可以通過化學法或者酶法合成植物甾醇酯，化學法生產植物甾醇酯過程中有副產物生成，產物需要分離除去催化劑等問題，而酶法生產植物甾醇酯則可以解決上述問題，同時溫和的反應條件和生物催化劑的無毒性，可以提高生產效率[4]。

脂肪酶催化大豆油和植物甾醇酯交換反應時，游離酶由于具有不易分離且成本較高等缺點在使用中受到限制。將游離脂肪酶固定化后，能夠增加單位面積內酶分子數量，提高反應效率，增強穩定性，增加使用次數，容易從反應中分離，從而有助于降低加工成本[5-6]。但是傳統的共價結合法固定是以酶蛋白上游離的活性基團，如氨基、羧基、羥基、巰基等，隨機與載體共價結合，會使部分處在活性中心的活性基團與載體結合形成新的鍵從而改變酶分子的活性中心結構，影響活性中心的作用效果，由此導致酶分子經固定化后活性大幅度降低[7]。

分子對接方法是指通過化學計量學模擬已知結構的受體（靶蛋白或活性位點）和配體間的相互作用識別，包括幾何結構和分子間作用力，同時預測受體-配體復合物結構的一種方法[8-9]。南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B，CALB）作為催化劑催化底物反應時，活性中心起到主要作用，通過分子對接，可以獲得CALB與其他分子結合時作用的活性位點。酶分子表面具有多種活性基團，如果在固定化過程中，使遠離活性中心的活性基團與載體進行共價結合，避免活性中心的參與，就能最大程度地保持酶分子活性中心的構象不受影響，由此提高固定化酶的活性。

本實驗通過分子對接技術研究CALB的活性中心，分析活性基團在酶分子上分布的特點，針對活性基團位置的分布特點，將MCM-41修飾成具有不同官能團的載體，并分別與游離的CALB進行固定化，研究修飾MCM-41載體對固定化CALB活性的影響。選取較優的固定化CALB研究其催化一級大豆油與植物甾醇的酯交換率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CALB（活性1 780.0 U/mL） 北京高瑞森生物科技有限公司；MCM-41 南京先豐納米材料科技有限公司；γ-氨丙基三乙氧硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）（98%）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 中國醫藥集團上海化學試劑公司；一級大豆油、橄欖油（均為食品級）九三糧油工業集團有限公司；植物甾醇、戊二醛等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DF-集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海耀特儀器設備有限公司；AR2140電子分析天平 上海精密其有限公司；JSM-2010F型透射電子顯微鏡 日本日立公司；7890A氣相色譜儀 美國安捷倫公司；BPG-9056干燥箱上海一恒儀器有限公司；KQ-250V超聲波振蕩器 昆山市超聲儀器有限公司；HH-1水浴鍋 上海越眾儀器設備有限公司；PHs-3C型pH計 上海偉業儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 CALB活性中心及MCM-41修飾特性

1.3.1.1 CALB與配體分子對接

小分子的結構采用Chemdraw 11.0進行處理，將所得結果保存成mo12格式，然后用Autodock 4.0保存成pdbqt文件；通過同源建模獲得蛋白1GWC.pdb結構，用Autodock 4.0處理蛋白結構，通過加氫、計算電荷、合并非極性氫后保存成pdb文件，最后保存成pdbqt文件；打開大小分子的pdbqt文件，然后以蛋白的活性位點為中心（center x＝23.418，center y＝9.189，center z＝25.079），構建一個60×60×60的盒子，保存成gpf文件，通過autogrid運算生成glg文件；打開大小分子的pdbqt文件，利用默認的軟件參數，小分子結構采取柔性方式，運算60 次，保存成dpf文件，通過Autodock運算生成dlg文件[10-11]。

1.3.1.2 CALB的氨基酸殘基

通過在蛋白質數據庫（Protein Data Bank，PDB）中查找，得到CALB的氨基酸序列，查找出其中帶有活性基團及氨基酸殘基，用RASWIN模擬出酶分子的結構及氨基酸殘基分布，對CALB分子上的活性基團所屬的氨基酸殘基位置分布進行考察。

1.3.1.3 MCM-41的表面修飾

MCM-41氨基修飾：稱取2.5 g MCM-41于表面皿中，在150 ℃條件下放置在干燥箱中24 h。在150 mL無水乙醇中加入2 g MCM-41和2 g γ-氨丙基三乙氧基硅烷。將得到的懸濁液在5 000 r/min條件下進行超聲分散處理30 min。再將得到的懸濁液600 W、22 000 Hz超聲振蕩處理30 min。將得到的懸濁液在水浴中加熱蒸發掉溶劑后，加入一定量的無水乙醇重復蒸發2 次，使用研缽研磨得到γ-氨丙基三乙氧基硅烷改性的氨基功能化MCM-41（NH2-MCM-41）[12]。

氨基功能化MCM-41的活化：在無水乙醇中加入20 mL NH2-MCM-41，再添加25%戊二醛溶液25 mL，在溫度40 ℃，攪拌速率200 r/min處理10 h，反應結束后獲得的載體即帶有醛基活性基團（G-MCM-41）。將獲得的載體分別用無水乙醇及去離子水沖洗4 次，再將其加入20 mL的去離子水中待用[13]。

1.3.1.4 修飾后的MCM-41載體固定CALB

G-MCM-41與CALB的固定：用磷酸緩沖液（pH 7.0）配制質量濃度為14 mg/mL的CALB酶液，在50 mL酶液中加入100 mg制得的帶醛基活性基團的載體G-MCM-41，45 ℃反應5 h，反應結束后，收集固態酶，得到載體與游離ε-NH2通過共價結合法固定的CALB（G-MCM-41-CALB），最后用磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌3 次，測定其酶活性[14]。

NH2-MCM-41與CALB的固定：參照Kuo等[15]的方法，將2 mg EDC（2.6 mmol/L）加入到4 mL含有脂肪酶的磷酸鹽（pH 8.5、50 mmol/L）緩沖溶液中，并將溶液25 ℃、150 r/min振蕩反應1 h。然后，向溶液中加入2.4 mg NHS（5.2 mmol/L），反應1 h，獲得被活性酯修飾過的酶。接著向溶液中加入50 mg表面修飾后的NH2-MCM-41，30 ℃、150 r/min振蕩反應4 h，得到載體與—COOH通過共價結合法固定的CALB（NH2-MCM-41-CALB），最后用磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌3 次，測定其酶活性[16]。

1.3.2 活性高的固定化CALB催化大豆油與植物甾醇酯交換

1.3.2.1 單因素試驗

稱取一定量的一級大豆油加入錐形瓶中，加入植物甾醇、固定化脂肪酶和轉子，置于集熱式磁力攪拌器中，攪拌速率為400 r/min，調整溫度，磁力攪拌反應一段時間后停止加熱，反應物轉入離心管中，4 000 r/min離心20 min后，取出上層油脂制品。研究反應溫度、固定化脂肪酶的添加量、植物甾醇質量分數、反應時間對酯交換反應轉化率的影響[17]。

1.3.2.2 響應面優化試驗

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface analysis

如表1所示，以反應溫度、G-MCM-41-CALB添加量、植物甾醇質量分數、反應時間為自變量，以轉化率為響應值，研究各因素對酯交換反應轉化率的影響。

1.3.3 指標的測定

1.3.3.1 CALB活性及相對酶活性的測定

CALB活性采用水解橄欖油乳化液的方法測定[18]。配制2%聚乙烯醇溶液，再加入橄欖油配成溶液，置于5～10 ℃水中，充分攪拌20 min，直至變成乳白色聚乙烯醇-油乳化液。以2.5 mL體積分數25%橄欖油乳化溶液作為底物，加入2 mL、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），37 ℃水浴10 min后，加入0.5 mL游離脂肪酶（0.2 g固定化脂肪酶），在37 ℃水浴30 min后，加入5.0 mL乙醇-丙酮混合溶液（1∶1，V/V）終止反應，然后加入5.0 mL 0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液，再用0.05 mol/L鹽酸溶液滴定反應溶液，計算出游離脂肪酸含量，脂肪酶的一個活性單位定義為在測定條件下每分鐘釋放1 mmol脂肪酸的脂肪酶添加量。相對酶活性按式（1）計算：

1.3.3.2 酶蛋白負載量的測定

反應體系中C A L B蛋白的質量濃度測定采用Bradford[19]的方法，酶蛋白負載量按式（2）計算：

式中：C1和C2分別為反應體系中起始和反應后的CALB蛋白質量濃度/（mg/mL）；V為反應液的體積/mL；m為載體MCM-41質量/g。

1.3.3.3 酯交換轉化率的測定

通過氣相色譜檢測產品的峰值。色譜柱：CP-Sil-88石英毛細柱（0.32 mm×5 m，0.1 μm）；程序升溫：150 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至370 ℃，保持5 min；分流比為80∶1；注入器和檢測器溫度為370 ℃；載氣為氦氣，流量7.0 mL/min。酯交換反應轉化率按式（3）計算：

式中：植物甾醇和植物甾醇酯的峰值通過氣相色譜測得到，峰值區域與質量濃度呈正比。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 CALB活性中心及修飾MCM-41固定化脂肪酶效果

2.1.1 分子對接結果

使用軟件將CALB與甘油三酯進行分子對接，在對接過程中僅設定底物與酶的部分殘基可以移動，酶的其它部分固定不動。以CALB為受體，三亞油酸甘油三酯為配體，三亞油酸甘油三酯可由甘油與油酸酯化合成，由3 條結構相同的支鏈組成，每條支鏈包含2 個雙鍵。經過Chemdraw 11.0優化后，得到三亞油酸甘油三酯的長度值為29.9 ?。利用Autodock 4.0對其進行分子對接結果如圖1所示。

圖1 CALB與配體對接結果Fig. 1 Lipase docking with ligand

從圖1可以看出，小分子配體主要通過疏水、氫鍵、范德化力進入靶點蛋白活性位點，CALB與三亞油酸甘油三酯進行了很好的對接，多種氨基酸參與了與配體的作用，CALB與甘三酯結合的活性中心是由Ser-105、Asp-187和His-224三個氨基酸殘基通過氫鍵組成的三維空間結構，CALB的活性中心為三聯體“Ser-His-Asp”催化結構，與Uppenberg等[20]的研究結果一致。

2.1.2 CALB的基團組成

表2 CALB的氨基酸活性基團及殘基個數Table 2 Number of amino acid active groups and residues in CALB

從PDB中的CALB 3D結構，選定PDB ID∶4ZV7，如表2所示，在CALB氨基酸殘基中存在ε-NH2、—COOH、—OH及—SH等活性基團。活性基團在酶分子中的組成對酶的固定化有重要作用，通過CALB活性基團組成合理選擇修飾到載體上的官能團種類[21]。

2.1.3 CALB分子的氨基酸殘基分布

經分子對接結果可知，CALB分子催化三聯體為Ser-105、Asp-187和His-224，利用RASWIN軟件模擬得到具有4 個活性基團的氨基酸殘基分布如圖2所示。

圖2 CALB分子的氨基酸殘基分布Fig. 2 Distribution of amino acid residues in CALB molecule

由圖2a可以看出，Lys殘基主要是游離ε-NH2活性基團，Lys殘基的位置距離活性中心較遠，游離ε-NH2的分布比較分散，在活性中心附近沒有發現游離ε-NH[22]。2由圖2b可以看出，Asp、Glu殘基主要是—COOH活性基團，—COOH大部分分布在遠離酶活性中心的位置上，僅一小部分分布在活性中心。由圖2c可以看出，Ser、Thr、Tyr殘基主要是—OH活性基團，—OH含量多且分布范圍廣泛，并且在CALB催化活性中心分布較多，如果以—OH為結合位點，將會影響酶分子活性中心的活性。由圖2d可以看出，Cys殘基主要是—SH活性集團，—SH含量較少，且分布較為分散，若以其為結合位點，固定化效率降低[23]。

因此，首先將MCM-41載體修飾成具有氨基官能團的載體，以期能易與CALB的—COOH連接制得NH2-MCM-41-CALB。再將MCM-41載體修飾成具有醛基官能團的載體，以期能易與CALB的ε-NH2連接制得G-MCM-41-CALB[24]，研究2 種官能團載體對CALB固定化的效果。

2.1.4 修飾MCM-41載體固定CALB的效果

圖3 載體與CALB固定效果Fig. 3 Immobilization efficiencies of CALB with different carriers

由圖3可以看出，2 種載體固定得到的固定化CALB蛋白負載量均較高。用APTES對MCM-41載體改性得到的具有氨基官能團的載體NH2-MCM-41表面含有大量氨基，而CALB蛋白上最容易與氨基反應的基團是羧基，因此可以推測當CALB與NH2-MCM-41固定化時，改性后的載體NH2-MCM-41上大量的氨基與脂肪酶的羧基共價結合，制得的NH2-MCM-41-CALB活性較低，NH2-MCM-41載體加入戊二醛后得到的具有醛基官能團的載體G-MCM-41與CALB固定時，CALB表面的氨基與載體表面的氨基通過戊二醛交聯固定[25]制成的G-MCM-41-CALB的活性較高。具有醛基官能團的載體易與游離ε-NH2共價結合，CALB含有游離ε-NH2的Lys殘基分布在距離活性中心較遠的位置（圖2a），生成的共價鍵遠離活性中心，對酶的活性影響較小[26]。具有氨基官能團的載體易與—COOH共價結合，CALB活性中心附近有一定量的—COOH（圖2b），并且由分子對接結果可知含有—COOH的Asp187為催化三聯體之一，當氨基與CALB活性中心附近少量的—COOH形成共價鍵時，就會影響CALB分子的活性中心構象，使NH2-MCM-41-CALB活性降低。

2 種不同官能團的載體對CALB固定結果與CALB分子的氨基酸殘基分布結論吻合，具有醛基官能團的載體與游離酶的ε-NH2結合制成的G-MCM-41-CALB活性較高，因此，后續僅研究G-MCM-41-CALB特性。

2.2 G-MCM-41-CALB催化大豆油與植物甾醇酯交換反應的單因素試驗結果

2.2.1 反應溫度對酯交換反應轉化率的影響

圖4 反應溫度對酯交換反應轉化率的影響Fig. 4 Effect of reaction temperature on transesterification rate

以一級大豆油為底物，pH值為7.0，植物甾醇質量分數6.0%，酯交換時間5.0 h，G-MCM-41-CALB添加量為2.0%，攪拌速率400 r/min，結果如圖4所示。隨著體系反應溫度的升高，G-MCM-41-CALB催化大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應轉化率呈先逐漸增加后逐漸降低的趨勢（P＜0.05），隨著溫度升高體系的黏度逐漸降低，反應體系內分子的運動速度加快，分子間的傳質速率提高，促進了酶顆粒與底物之間的相互作用，當反應溫度升高到50 ℃時酯交換反應轉化率達到最高。隨著反應溫度的繼續升高，可能破壞了酶分子的空間構象，導致酶分子的活性逐漸降低，G-MCM-41-CALB催化大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應轉化率逐漸降低（P＜0.05），這一結果與Takanami等[27]研究的結果一致。

2.2.2 G-MCM-41-CALB添加量對酯交換反應轉化率的影響

圖5 G-MCM-41-CALB添加量對酯交換反應轉化率的影響Fig. 5 Effect of G-MCM-41-CALB dosages on transesterification rate

以一級大豆油為底物，pH值為7.0，植物甾醇質量分數6.0%，反應溫度50 ℃，反應時間5.0 h，攪拌速率400 r/min，結果如圖5所示。隨著G-MCM-41-CALB添加量的增加，大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應轉化率逐漸升高（P＜0.05），隨著G-MCM-41-CALB添加量的增加，G-MCM-41-CALB會提供較多的活性位點，增加了G-MCM-41-CALB與底物接觸碰撞的機會。當G-MCM-41-CALB的添加量達到2.0%時，酯交換反應轉化率上升不再明顯，這可能是因為加酶量增多后，酶聚集在一起使其與底物接觸的面積相對減少，脂肪酶不能更好地發揮其催化作用，從而導致酯交換轉化率上升不明顯，并且過多的酶用量也不利于產品精煉[28]。

2.2.3 植物甾醇質量分數對酯交換反應轉化率的影響

圖6 植物甾醇質量分數對酯交換反應轉化率的影響Fig. 6 Effect of phytosterol concentrations on transesterification rate

以一級大豆油為底物，pH值為7.0，反應溫度50 ℃，酯交換時間5.0 h，G-MCM-41-CALB添加量2.0%，攪拌速率400 r/min，結果如圖6所示。隨著植物甾醇質量分數的增加，G-MCM-41-CALB催化大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應轉化率呈先逐漸增加后逐漸降低的趨勢（P＜0.05）。隨著植物甾醇質量分數的增加，增加了植物甾醇的羥基吸附固定化酶活性中心的幾率，大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應轉化率逐漸增加，當植物甾醇質量分數為5.0%時大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應轉化率達到最高值。隨著植物甾醇質量分數繼續增加，植物甾醇在一級大豆油中的溶解度達到了飽和狀態，底物中植物甾醇的羥基與固定化酶活性中心的吸附與解吸達到了動態平衡，大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應轉化率逐漸降低。這一結果與王騰宇等[29]研究結果一致，其研究發現酯交換反應的最佳植物甾醇質量分數為5.0%。

2.2.4 反應時間對酯交換反應轉化率的影響

圖7 反應時間對酯交換反應轉化率的影響Fig. 7 Effect of reaction time on transesterification rate

以一級大豆油為底物，pH值為7.0，反應溫度50 ℃，植物甾醇質量分數5.0%，G-MCM-41-CALB添加量2.0%，攪拌速率400 r/min，結果如圖7所示。隨著反應時間的延長，G-MCM-41-CALB催化大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應轉化率呈先逐漸增加后趨于平穩。在反應起始階段，G-MCM-41-CALB的活性較高，隨著反應時間延長，G-MCM-41-CALB與底物之間的接觸充足，G-MCM-41-CALB催化大豆油脂與植物甾醇的酯交換反應轉化率逐漸增加（P＜0.05），當反應時間3.0 h時，酯交換反應轉化率達到了85.1%。隨著反應時間繼續延長，G-MCM-41-CALB與底物之間的吸附與解吸達到平衡，酯交換反應轉化率增加緩慢（P＞0.05）。這一結果與Gharat等[30]研究結果一致，表明在最初的4 h內轉化率達到86.6%，但隨著反應進一步進行，酯交換反應4 h后轉化率只有微小的變化。

2.3 G-MCM-41-CALB催化酯交換反應優化試驗

如表3、4所示，將試驗所得數據進行多元回歸擬合，得到轉化率（R1）對反應溫度（A）、G-MCM-41-CALB添加量（B）、植物甾醇質量分數（C）以及反應時間（D）的回歸方程為R1=87.33-0.27A＋1.44B＋0.16C＋0.35D-0.18AB-0.11AC＋0.37AD-0.60BC＋0.18BD-0.91CD-9.49A2-3.48B2-3.21C2-3.77D2。

由表4可知，方程的自變量和因變量間具有顯著的線性關系，該模型回歸顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05），并且該模型R2為0.999 1，R2Adj為0.998 2，說明該模型與試驗擬合良好。

表3 響應面試驗設計方案及結果Table 3 Design scheme and experimental results for response surface analysis

表4 方差分析結果Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

圖8 各因素交互作用對酯交換轉化率影響的響應面圖Fig. 8 Response surface plots showing interactive effects of variables on transesterification rate

由圖8可知，2 個因素交互影響時，保持一個因素不變，轉化率隨著另一個因素變化呈現先增加后降低的趨勢，其中，反應溫度和反應時間、G-MCM-41-CALB添加量和植物甾醇質量分數、植物甾醇質量分數和反應時間之間交互作用較為顯著。通過試驗設計優化得到G-MCM-41-CALB催化酯交換反應過程的最佳工藝參數為反應溫度49.92 ℃、G-MCM-41-CALB添加量2.1%、植物甾醇質量分數5.0%、反應時間3.05 h，該條件下轉化率預測值為87.5%。根據實際情況將工藝參數進行整理，得出整理值為反應溫度50 ℃、G-MCM-41-CALB添加量2.1%、植物甾醇質量分數5.0%、反應時間3.0 h。為證明響應面優化出的條件下所得結果的可靠性，按照上述整理值進行3 組平行實驗，得到的轉化率平均值為87.4%，預測值與實驗值之間具有良好的擬合性，從而證實了模型的有效性。

3 結 論

將CALB與三亞油酸甘油三酯進行分子對接，發現活性中心由Ser-105、Asp-187和His-224構成，在CALB活性中心發現大量的—OH及部分—COOH而沒有發現游離ε-NH2。根據CALB活性基團的分布特點將MCM-41修飾成2 種不同官能團的載體。具有氨基官能團的載體易與—COOH結合，有部分結合位點在活性中心附近，使NH2-MCM-41-CALB活性降低。具有醛基官能團的載體易與ε-NH2結合，結合位點遠離活性中心，G-MCM-41-CALB具有較高活性。結果與CALB分子的氨基酸殘基分布結論吻合。G-MCM-41-CALB催化酯交換率達到87.4%。