風干腸貯藏過程中揮發性風味物質的變化及異味物質分析

吳倩蓉，周慧敏，李 素，朱 寧，張順亮*，趙 冰，潘曉倩，喬曉玲，陳文華，曲 超

（中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068）

風干腸是我國傳統腌臘肉制品臘腸的一種，風味是評價其品質的重要指標之一，也是消費者購買時所參考的重要因素。多種化合物共同作用的結果形成肉及其制品的風味物質，對肉制品風味的研究主要包括滋味和氣味兩方面[1-2]。滋味是非揮發性物質，主要來源于呈味物質，如無機鹽、核酸代謝產物等；氣味的呈味物質主要為肌肉在加工過程中產生的揮發性風味物質刺激鼻腔嗅覺受體，例如不飽和羰基化合物、含硫化合物及一些雜環化合物等[3]。貯藏對肉制品品質有很大影響，適當的貯藏時間可以使風味物質通過氨基酸的Strecker降解、美拉德反應等，呈現更好的風味。貯藏時間過長，肉制品中的脂肪組織過度氧化，生成一些醛酮類的過氧化物，會產生讓人不愉快的異味，影響產品品質[4]。

進行揮發性風味物質的測定前，需要對樣品進行前處理，對揮發性風味物質進行提取富集。常用的處理方法主要包括超臨界流體萃取法、同時蒸餾萃取法、吹掃捕集技術以及固相微萃取法等[5-6]。氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術在肉制品揮發性物質的檢測中一直發揮著巨大的作用[7-8]，氣相色譜-嗅聞（gas chromatographyolfactometry，GC-O）技術將GC分離化合物的能力與人的嗅覺相結合，以便更好地鑒定氣味活性物質及其對總體風味的貢獻。氣味活度值[9]（odour activity value，OAV）是風味物質濃度與其在水中閾值的比值，一般情況下用于評價不同種化合物對樣品總體風味的貢獻。OAV大于1，說明該物質可能對樣品的總體風味有直接影響。在一定范圍內，某揮發性物質的OAV越大，說明其對總體風味的貢獻值越大[10]。

近年已有不少關于臘腸的研究報道，如茶多酚[11]、硝酸鹽[12]、細菌納米纖維素[13]、豬肉品種[14]、發酵劑[15]等對臘腸品質的影響；錢敏等[16]對7 種市售廣式臘腸的揮發性香氣成分進行分析，測定出37 種有效成分，主要為酯類物質；許鵬麗等[17]分析檢測出廣式臘腸中的揮發性風味物質主要為乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯，脂肪氧化是臘腸劣變的主要原因；Marco等[18]通過固相微萃取對香腸的揮發性風味物質進行檢測；唐玲[19]對廣式臘腸貯藏期間脂質水解氧化與風味成分的相關性進行研究，結果表明臘腸主要揮發性物質有丁酸乙酯、戊酸乙酯等酯類物質和乙醇，隨著脂肪氧化產生較多的醛、酮類物質，對臘腸風味造成負面影響；Sun Weizheng等[20]對不同加工和貯藏階段臘腸揮發性物質進行分析，共鑒定出104 種化合物，主要是酯類和醇類，脂肪氧化、氨基酸分解代謝以及微生物活性都對臘腸揮發性風味物質的形成起到積極作用。但對于加工過程中揮發性風味物質以及異味物質的研究較少。

本研究通過動態頂空制樣-熱脫附-GC-MS聯用技術對不同貯藏時間的風干腸樣品中揮發性風味物質進行定性定量分析，并結合OAV量化評價不同揮發性物質對總體風味的貢獻程度，同時結合嗅聞技術以及感官評價，研究貯藏過程中風干腸揮發性風味物質的變化，以及造成風干腸貯藏過程中異味的主要物質，為風干腸保鮮劑和異味抑制劑的開發提供支持，為優化其貯藏條件及提高風味品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬4號肉、背脂 北京中瑞食品有限公司；腸加工用輔料（亞硝酸鈉、鹽、白砂糖、香辛料等） 北京金美添技術發展有限公司；2-甲基-3-庚酮標準品、系列正構烷烴 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

4822絞肉機 美國Hobart公司；OSCAR 20真空灌腸機 德國海因里希弗雷機械制造有限公司；BYXX-50煙薰箱 艾博儀器設備有限公司；Gerstel TDS半自動熱脫附進樣器、Tenax-TA石英玻璃吸附管、TC-20型Tenax-TA吸附管自動凈化儀、ODP2嗅聞檢測儀德國Gerstel公司；GC-MS聯用儀、TG-Wax MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；動態頂空制樣瓶 自制。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

工藝流程：豬肉修整（剔除筋膜）→絞碎（5mm孔板）→攪拌→灌腸→干燥→冷卻→包裝→貯藏（37 ℃）。

產品配方：4號肉與背脂質量比為4∶1；配料（根據原料質量按比例添加）：亞硝酸鈉0.003%、鹽1.8%、白砂糖1%、葡萄糖0.5%、味精0.2%、白酒1%、生抽2%、五香粉0.15%、異VC鈉0.15%、冰水10%。

制作成品：于37 ℃條件下貯藏0、7、14、21、35、49 d和77 d，共7 個樣品，分別標記為S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6。貯藏77 d后的樣品明顯變黑，無光澤，異味強烈，完全不可接受，故貯藏至77 d后停止實驗；為加速風干腸的氧化變質，以確定造成異味的主要物質，貯藏溫度為37 ℃。

1.3.2 樣品前處理

在室溫條件下將樣品切碎混勻，準確稱取10 g樣品置于動態頂空制樣樣品瓶中，旋緊瓶蓋，加入1 μL質量濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮標準品作為內標物，使用TA吸附管進行樣品富集，55 ℃保溫，平衡10 min；一端通氮氣，吹掃流速為50 mL/min，另一端接TA吸附管（經老化，無雜質峰），吸附40 min后取出吸附管插入熱脫附進樣口進樣，每個樣品平行測定3 次取平均值。

1.3.3 熱脫附程序

參考周慧敏[21]、李素[22]等的方法，并進行適當調整。

熱脫附程序：采用標準加熱模式，氦氣流速20 mL/min，不分流；初始溫度40 ℃，延遲0.1 min，保持0.1 min；以40 ℃/min上升到210 ℃，保持5 min；傳輸線溫度為215 ℃。

冷進樣條件：采用標準加熱模式；液氮冷卻；初始溫度-100 ℃，平衡0.1 min；以10 ℃/min升到215 ℃，保持5 min；分流比20∶1。

1.3.4 揮發性風味物質成分的測定

GC條件：TG-Wax MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（純度＞99.99%），流速1.0 mL/min；不分流模式，保持2 min。升溫程序：進樣口溫度250 ℃，起始柱溫40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min速率升溫至200 ℃，保持1 min；8 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持3 min。

MS條件：接口溫度260 ℃；傳輸線溫度230 ℃；電壓1.2 kV；電子電離源；溫度280 ℃；電子能量70 eV；全掃描模式，質量掃描范圍m/z40～600，掃描時間2 s。

1.3.5 嗅聞檢測

樣品經GC分離后以分流比1∶1進入質譜檢測器和嗅聞檢測器，接口溫度為200 ℃。選取3 名嗅覺靈敏并經過培訓的專業人員在嗅聞口進行嗅聞，記錄所聞到的氣味、保留時間、氣味特征以及氣味強度。強度分為5 個等級（1為氣味非常微弱、2為氣味微弱、3為氣味中等、4為氣味強烈、5為氣味非常強烈）。每種風味化合物的氣味描述以及時間需由至少2 名評價員同時確認，則將該描述記為最終實驗結果。

1.3.6 揮發性風味組分分析

定性分析：根據所得質譜圖，將所得化合物與美國國家標準與技術研究院NIST、Wiley等數據庫進行比對，保留時間大于45 min的物質為無香味的高沸點化合物，故刪除不進行分析，化合物的確定以反相似度指數和正相似度指數均大于800為準，標記為M。通過待測化合物的保留時間與相同條件下正構烷烴的保留時間計算待測化合物的保留指數（retention index，RI），與文獻值進行比對，標記為R，對不同貯藏時間的風干腸中揮發性風味物質進行定性分析。RI按式（1）計算：

式中：N為低碳原子數正構烷烴的碳原子數；n為高碳原子數正構烷烴碳原子數差；tx、tN＋n、tN分別為待測化合物保留時間、低碳原子數正構烷烴保留時間和高碳原子數正構烷烴保留時間/min。

定量分析：已知內標物2-甲基-3-庚酮的含量以及峰面積，根據化合物峰面積與含量的比值為定值，計算每一種風味化合物相對于內標物的含量，如式（2）所示：

式中：C為測定的揮發性化合物含量/（μg/kg）；Ax為測定揮發性化合物的峰面積/（AU·min）；C0為內標物質量濃度（0.816 μg/μL）；A0為內標物的峰面積/（AU·min）；V為內標物的進樣量/μL；m為測定樣品的質量/g。

1.3.7 OAV的計算

參考張凱華等[23]的方法，按式（3）計算：

式中：C為實驗測定計算所得揮發性化合物質量濃度/（μg/kg）；T為同物質在水中的察覺閾值/（μg/kg）。

1.3.8 感官評價

參照GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評定規范》[24]的要求，制定感官評價標準，選取10 名食品專業技術人員，經過相關培訓后，對不同貯藏時間的風干腸進行感官評價。感官評價實行10 分制原則，根據喜好程度增強采取分段式規則，評價人員分別打分互不干擾，結果取平均值，具體評分標準如表1所示。

表1 感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation

1.4 數據處理

采用Excel對平均值、標準差、RI等數值進行計算以及繪圖；利用SPSS Statistics 21.0對原始數據進行Duncan顯著性差異分析（P＜0.05，差異顯著）以及Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏時間風干腸中揮發性風味物質的鑒定結果

使用動態頂空制樣-熱脫附-GC-MS對不同貯藏時間的風干腸中揮發性風味物質進行鑒定，如表2所示，不同樣品組分別檢出揮發性風味物質59、56、63、58、73、68、71 種，主要為酯類、烴類以及醇類化合物，還檢測到少量醛類、酮類、酸類及其他雜環類物質。

表2 不同貯藏時間風干腸中揮發性風味物質含量Table 2 Relative contents of volatile flavour compounds in sausages stored for different times

續表2

7 個不同貯藏時間的風干腸樣品中檢測到的揮發性風味物質總量分別為4 729.08、8 933.34、5 488.03、7 737.41、7 990.80、8 763.65、12 774.14 μg/kg，其中酯類物質占絕大部分，分別為52.95%、57.63%、64.00%、62.76%、70.00%、69.29%、65.24%（圖1）。

圖1 各類揮發性風味物質在不同樣品中的百分比Fig. 1 Proportion of each class of volatile flavour compounds in different samples

2.2 貯藏時間對風干腸中各類揮發性風味物質的影響

2.2.1 酯類化合物分析

如表2和圖1所示，檢測到的揮發性風味物質中有50%以上為酯類物質，7 組樣品中分別檢測出22、23、24、25、30、28、26 種，主要為己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯。酯類物質主要來源于配料中的白酒表現出顯著的果香以及濃郁的酒香，同時延長產品貨架期；脂肪水解產生的游離脂肪酸也可能與脂肪氧化產生的醇發生酯化反應生成酯類物質，賦予風干腸特殊的風味[25]。酯類物質隨著貯藏時間的延長，呈現出先增加后減少，隨后又增加的趨勢，這可能是由于風干腸貯藏過程中發生美拉德反應生成酯類物質，賦予風干腸獨特的風味；隨后酯類物質降解生成的化合物可能與氨基酸或美拉德反應的中間產物進行后續反應，生成風味化合物，對肉的整體芳香氣味有貢獻[26]。

2.2.2 醇類化合物分析

7 種樣品中分別檢出醇類化合物12、7、11、10、12、11、10 種，主要為乙醇、1-辛烯-3-醇等，可能來源于配料中添加的白酒、香辛料等配料，也可能來自于脂肪的氧化。隨著貯藏時間的延長，乙醇含量逐漸下降，這是由于乙醇易揮發，以及在貯藏過程中，一部分參與了酯化反應以形成風干腸獨特的風味。

2.2.3 醛類化合物分析

從表2可以看出，醛類物質隨貯藏時間的延長而增加，這可能是由于貯藏過程中發生脂肪的水解氧化、氨基酸的Strecker降解以及微生物作用造成[27]。其中正己醛含量從94.70 μg/kg增加至651.31 μg/kg，反,反-2,4-癸二烯醛含量從32.75 μg/kg增加至419.49 μg/kg，庚醛、辛醛、壬醛含量也有一定的增加。小分子的醛類物質具有一定的刺激性氣味[28]，對風干腸的風味會造成一定的負面影響。

2.2.4 酮類以及酸類化合物分析

不同樣品組中，分別檢測到酮類物質2、2、1、1、3、4、5 種，主要是2-庚酮、2-甲基四氫呋喃-3-酮等，可能來源于脂肪的氧化降解，也可能來源于醇類物質的氧化或酯類化合物的降解作用。檢出酸類物質分別為4、6、5、4、4、3、5 種，主要為己酸、丁酸、正戊酸、異辛酸、正辛酸等，可能來源于酯類化合物的氧化降解。但酮類物質和酸類物質在水中的察覺閾值相對較高，OAV較小，對風味整體貢獻不明顯。

2.2.5 烴類化合物分析

從表2可以看出，不同貯藏時間樣品檢測到的烷烴類化合物中，正己烷的含量最高。烷烴類物質主要來源于脂肪的氧化，正構烷烴可能是由于脂肪的自動氧化產生，支鏈烷烴則可能是來源于原料中支鏈脂肪酸的氧化[29]。烯烴類物質主要為D-檸檬烯和α-姜黃烯，D-檸檬烯具有柑橘、薄荷味，可能來源于產品制備中加入的香辛料。不同貯藏時間樣品中檢出的芳香烴類物質主要為乙基苯、鄰異丙基甲苯和苯酚，可能來源于芳香族氨基酸的Strecker降解，也可能來自飼料在原料肉中的累積和添加的香辛料[30]。但烴類物質的察覺閾值一般較高，對風味整體貢獻不明顯。

2.2.6 其他類化合物分析

不同樣品組中還檢測出一些雜環類物質，其中茴香腦含量最高，這可能來源于制作過程中所添加的香辛料，但其在水中的察覺閾值較高，對風干腸整體風味的貢獻不明顯。其他雜環類物質包括桉葉油素、2-甲基萘、2-乙酰基吡咯等，其相對質量濃度都相對較低。各類揮發性風味物質的含量高低并不能直接說明其對整體風味貢獻的大小，之后結合OAV以及GC-O-MS結果進行進一步的分析。

2.3 風干腸中風味活性化合物分析

如表3所示，7 組不同貯藏時間的樣品中，對風干腸風味貢獻較大的化合物分別有19、17、20、19、19、17、19 種。揮發性風味物質的OAV不僅與風味物質總量，也與其在水中的察覺閾值有關。從風味物質總量看，正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、正己醛、苯甲酸乙酯、丁酸乙酯等酯類物質總量較高，但由于各類物質察覺閾值不同，異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、反,反-2,4-癸二烯醛、正己酸乙酯、丁酸乙酯、正辛醛等風味活性物質OAV相對較高，酯類物質主要為果香味，醛類物質為脂肪味，對風干腸樣品的整體風味有重要貢獻。

表3 風干腸樣品中揮發性風味物質OAVTable 3 OAVs of volatile flavour compounds in samples stored for different times

2.4 風干腸樣品感官評價結果

圖2 風干腸感官評分Fig. 2 Sensory scores of sausages stored for different times

從圖2可以看出，隨著貯藏時間的延長，風干腸色澤逐漸變暗，從亮紅色到暗紅色，褐色，最終變為黑色，這是由于貯藏過程中脂肪氧化造成的。香氣評分在貯藏過程中先增加后降低，風干腸成品為肉香味而無明顯的臘味；隨著貯藏時間的延長，脂肪氧化、氨基酸降解等產生風干腸特有的臘味，之后風味評分逐漸下降，可能與其腐敗變質有關。可接受度指標評價中S1、S2樣品組有較高評分，說明樣品的色澤、風味均處于優質狀態，無異味，之后樣品組色澤變暗，異味逐漸增強，可接受度下降，評分明顯降低。

表4 感官評分與揮發性成分Pearson相關系數Table 4 Pearson correlation between sensory scores and volatile components

將感官評分與揮發性成分進行Pearson相關性分析，如表4所示，分別有21、21、17 種揮發性成分與色澤、風味以及可接受度顯著相關，包括辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁內酯、1-辛烯-3-醇、4-乙基環己醇、3-呋喃甲醇、苯乙醇、反,反-2,4-癸二烯醛等。

2.5 嗅聞結果及風干腸異味物質分析

表5 GC-O法鑒定不同貯藏時間風干腸樣品中的風味活性物質Table 5 Flavor-active compounds in sausage samples stored for different times identi fi ed by GC-O

如表5所示，不同貯藏時間的樣品分別檢測到10、16、15、16、14、14、17 種，遠小于由質譜檢測得到的揮發性物質種類，說明大部分揮發性物質沒有香氣特征，或無法通過嗅聞檢測到，從嗅聞口得到的香氣特征主要包括水果味、甜味、脂肪味、油脂味等。乙醇（甜味，酒味）以及酯類物質如異戊酸乙酯（水果味）、2-甲基丁酸乙酯（蘋果味）、癸酸乙酯（葡萄味）等強度較大，對風干腸的風味貢獻較大；茴香腦（甜，清涼，藥草味）是由于風干腸制作過程中所添加香辛料中的揮發性成分，主要提供辛香。

對比OAV以及GC-O-MS的結果，共同確定的風味活性物質有16 種，說明2 種鑒定方法具有一致性。但是OAV小于1的乙醇、茴香腦在GC-O-MS中鑒定為風味活性物質，而OAV大于1的D-檸檬烯、桉葉油素、芳樟醇等物質在GC-O-MS中并未鑒別出來，說明2 種方法存在差異性。結合2 種風味活性物質鑒定方法以及感官評價結果可以看出，貯藏時間對樣品中揮發性物質的OAV有影響，隨著貯藏時間的延長，風干腸異味逐漸加重，色澤變暗，可接受度降低；辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇以及醛類物質包括正己醛、庚醛、正辛醛、壬醛、反,反-2,4-癸二烯醛的OAV增大，在嗅聞實驗中被檢測到且氣味強度增加，對整體風味影響貢獻值較大，其中辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇和反,反-2,4-癸二烯醛與感官評分具有顯著相關性。這些物質使風干腸具有脂肪酸敗味以及哈喇油味，可能是造成貯藏過程中風干腸異味的主要物質。

3 結 論

使用動態頂空制樣-GC-O-MS聯用技術對不同貯藏時間的風干腸進行揮發性風味物質的分析，在37 ℃貯藏0（成品）、7、14、21、35、49 d和77 d的樣品中分別檢出揮發性風味物質59、56、63、58、73、68、71 種，總量分別為4 729.08、8 933.34、5 488.03、7 737.41、7 990.80、8 763.65、12 774.14 μg/kg，其中酯類物質的相對含量最高（52.95%～70.00%），還檢測出醇類、醛類、酮類、酸類、烴類以及其他雜環類物質，共同組成風干腸的風味。隨著貯藏時間的逐漸延長，總揮發性風味物質的含量基本呈相對增加趨勢（P＜0.05），其中貯藏7 d的樣品中總揮發性風味物質含量高于貯藏14 d的樣品，這可能是由于成品在貯藏初期脂肪氧化生成一些酯類物質賦予風干腸特殊的臘味。7 組樣品中OAV大于1的風味物質分別有19、17、20、19、19、17、19 種，結合不同樣品的感官評價以及嗅聞實驗結果表明：隨著貯藏時間的延長，風干腸樣品的顏色逐漸變暗，臘味逐漸降低，貯藏后期異味明顯加重，可接受度低，色澤、風味以及可接受度指標與辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇和反,反-2,4-癸二烯醛的含量具有顯著相關性（P＜0.05）。OAV大于1的風味物質中，經過GC-O鑒定，辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇以及醛類物質包括正己醛、庚醛、正辛醛、壬醛、反,反-2,4-癸二烯醛，其主要為脂肪味及哈喇油味，對風干腸的風味影響很大，可能是貯藏過程中風干腸氧化變質后產生的異味的主要物質。