東北6 種紅樹莓葉酚類化合物的鑒定及抗氧化活性分析

賈仕杰，張海華，張 煥，劉 暢，陳思睿，唐琳琳，王金玲,4,*

（1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省標檢產品檢測有限公司，黑龍江 哈爾濱 150000；3.黑龍江省譜尼測試科技有限公司，黑龍江 哈爾濱 150040；4.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

紅樹莓（Rubus ideaus L.）屬薔薇科懸鉤子屬，俗稱覆盆子、托盤等。紅樹莓在世界溫帶范圍內被廣泛種植[1]，我國東北地區是紅樹莓的主產區，資源豐富，種植歷史久，規模大，品種多。在過去的20 a中，樹莓和其他小漿果的產量不斷增長，市場也在不斷擴大[2]。然而紅樹莓葉的利用程度沒有紅樹莓果實高，僅有少數制成茶葉或用于醫藥用途，并未得到充分的利用[3-4]。近年來植物豐富的多酚類物質已成為目前研究的熱點[5]。曠慧等[6]對紅樹莓多酚的組分構成進行分析并通過脂質過氧化實驗證明其具有良好的抗氧化活性。有研究表明樹莓葉中的酚類物質含量較高，可作為天然的抗氧化劑來源[7]。

植物葉片中的酚類物質還被認為是各種飲料和加工食品中的功能性成分，并因其健康相關性質成為研究熱點[8-9]。Teleszko等[10]研究發現在漿果類植物中，葉片中的酚類物質明顯高于果實，與水果相比葉片具有更高的抗氧化能力。Han Na等[11]研究了樹莓葉乙醇提取物的抗血栓作用，結果表明從樹莓葉中分離出的山柰酚、槲皮素和銀鍛苷3 種物質對血漿復鈣時間有著明顯的延遲作用。Asmita等[12]通過大鼠實驗證明樹莓葉中的活性物質是通過特異性作用或受體介導途徑來調節平滑肌松弛度。

本研究對東北地區6 種不同品種的紅樹莓營養葉片的活性物質和抗氧化活性進行研究并通過超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法對其中的多酚進行定性定量分析，豐富樹莓研究相關數據，并為進一步開發和利用樹莓資源、提高樹莓附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

歐洲紅、澳洲紅、紅寶石、秋福、哈瑞泰茲、杜拉明6 種紅樹莓葉片均采自黑龍江省農業科學院園藝分院試驗田，2018年8月19日采莖尖第5～10片葉，密封冷藏避光運回東北林業大學食品科學實驗室凍藏。

標準品：蘆丁、槲皮苷、金絲桃苷、綠原酸、鞣花酸、異鼠李素、表兒茶素、兒茶素、丁香酸、沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草素（均為色譜純，純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

722S分光光度計 上海光譜儀器有限公司；FA2004電子天平 常熟市意歐儀器儀表有限公司；DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱 鞏義市予華儀器有限責任公司；PHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；6470液相色譜-質譜聯用儀（配有電噴霧離子源，Mass Hunter數據處理系統） 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 紅樹莓葉中活性成分含量測定

1.3.1.1 紅樹莓葉片水分含量

參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》測定6 種樹莓葉片中的水分活度，根據紅樹莓葉水分活度折算成每克紅樹莓葉干質量的活性物質含量及抗氧化活性能力。

1.3.1.2 樣品提取

紅樹莓葉解凍后研磨成勻漿，精確稱取5.00 g勻漿液加入50 mL含0.1%乙酸的甲醇溶液超聲提取1 h。將提取物于4 ℃黑暗環境中放置24 h，過濾并收集上清液（以上程序重復3 次）。在40 ℃條件下減壓旋轉蒸發餾分物質，合并餾分，用60%甲醇溶液定容至100 mL容量瓶中。用于酚類化合物分析和抗氧化評價[13]。

1.3.1.3 福林-酚法測定總酚含量

參考Pantelidis等[14]的方法測定。以沒食子酸為標準品，沒食子酸質量濃度（mg/mL）為橫坐標，765 nm波長處吸光度為縱坐標。其線性回歸方程為y=8.850 3x＋0.011 1（R2=0.999 1）。總酚含量根據紅樹莓葉含水量折算成每克紅樹莓葉干質量含總酚的質量（mg/g）。

1.3.1.4 硝酸鋁比色法測定總黃酮含量

參考張海悅等[15]的方法測定。以蘆丁為標準品，蘆丁質量濃度（mg/mL）為橫坐標，510 nm波長處吸光度為縱坐標。其線性回歸方程為y=1.022 9x＋0.000 3（R2=0.999 2）。總黃酮含量根據紅樹莓葉含水量折算成每克紅樹莓葉干質量含總黃酮的質量（mg/g）。

1.3.1.5 香草醛-硫酸法測定原花青素含量

參考孫蕓等[16]的方法測定。以兒茶素為標準品，兒茶素質量濃度（mg/mL）為橫坐標，500 nm波長處吸光度為縱坐標。其線性回歸方程為y=1.695 7x-0.001 0（R2=0.999 4）。原花青素含量根據紅樹莓葉含水量折算成每克紅樹莓葉干質量含原花青素的質量（mg/g）。

1.3.2 紅樹莓葉的抗氧化能力測定

1.3.2.1 鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）測定

參考Benzie等[17]的方法測定。以VC作陽性對照。紅樹莓葉片提取物采用恒質量法確定樣品質量濃度進行適當稀釋。通過比較不同紅樹莓葉片提取物中加入FRAP工作液后的吸光度大小，分析其FRAP強弱。

1.3.2.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定

參考孫麗萍等[18]的方法測定，稍有改動。在100 μL樣品中依次加入0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液4 mL，避光反應30 min，以去離子水為參比，在517 nm波長處測定吸光度（A1）；用等體積無水乙醇代替DPPH溶液，測定吸光度（A2），用等體積無水乙醇代替樣品，測定吸光度（A3）。VC為陽性對照。DPPH自由基清除率按式（1）計算：

1.3.2.3 2,2’-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulphonate)，ABTS）陽離子自由基清除能力測定

參考王振宇等[19]的方法測定，稍有改動。在100 μL樣品中加入ABTS溶液9 mL，避光反應6 min后，在734 nm波長處測定吸光度（Ai）；用等體積水代替ABTS溶液，測定吸光度（Aj），用等體積無水乙醇代替樣品，測定吸光度（A0）。VC為陽性對照。ABTS陽離子自由基清除率按式（2）計算：

1.3.3 紅樹莓葉中活性成分與抗氧化能力相關性分析

采用Pearson法對紅樹莓葉中總黃酮、總酚、原花青素與3 種抗氧化能力的相關性進行分析。

1.3.4 紅樹莓葉中多酚類物質的UPLC-MS/MS鑒定

1.3.4.1 樣品前處理

取1 mL提取液經0.45 μm微孔濾膜后轉移至進樣小瓶，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.4.2 單點外標法標準溶液配制

準確稱取10.00 mg標準品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇-二甲亞砜（90∶10，V/V）溶液溶解至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜過濾，制成1.0 mg/mL溶液作為對照溶液。在相同測定條件下，以標準品質量濃度為對照計算紅樹莓葉中目標物質的絕對質量濃度。

1.3.4.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相為A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。梯度洗脫程序：0～0.5 min，0%～90% A；0.50～2.00 min，90%～10% A；2.00～4.00 min，10% A；4.00～4.10 min，10%～90% A；4.10～6.00 min，90% A。

1.3.4.4 質譜條件

電噴霧離子源；接口電壓4 000 V；正離子與負離同時掃描；多反應監測模式，吹掃氣體為氮氣，氣體流量12 L/min；接口溫度325 ℃；脫溶劑管溫度325 ℃，加熱模塊溫度400 ℃；碰撞氣壓力138 kPa，氣體為高純氮氣。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 紅樹莓葉活性成分分析

表1 紅樹莓葉片水分含量Table 1 Moisture content of red raspberry leaves

圖1 紅樹莓葉總酚、總黃酮、原花青素含量Fig. 1 Contents of total polyphenols, total flavonoids and proanthocyanidins in red raspberry leaf extracts

如表1、圖1所示，6 種紅樹莓葉片提取物的總酚含量為3.48～5.56 mg/g；總黃酮含量為2.29～3.77 mg/g；原花青素含量為1.81～3.06 mg/g。歐洲紅和紅寶石的總酚含量較高，分別為（5.56±0.06）mg/g與（5.40±0.07）mg/g，二者之間在95%水平具有顯著性差異；總酚含量最低的為秋福（3.48±0.09）mg/g。歐洲紅的總黃酮含量最高，為（3.77±0.06）mg/g；總黃酮含量最低的為紅寶石（2.29±0.05）mg/g。哈瑞泰茲的原花青素含量最高，為（3.06±0.04）mg/g，原花青素含量最低的為秋福（1.81±0.03）mg/g。

6 種不同紅樹莓葉片中活性成分含量最高的為總酚，這與曠慧等[20]在紅樹莓果渣中測得的實驗結果相似。原花青素含量均為最低。但遲超[21]及寧瑋鈺[22]等的研究結果顯示，果籽與果實中的原花青素含量相對較高，分析其原因可能是取樣的部位不同，也可能是紅樹莓不同部位樣品的采摘時期不同及成熟度不同。

2.2 紅樹莓葉提取物抗氧化能力分析

2.2.1 ABTS陽離子自由基清除能力分析

圖2 紅樹莓葉提取物對ABTS陽離子自由基的清除能力Fig. 2 ABTS cation radical scavenging capacity of red raspberry leaf extracts

由圖2可知，當樣品質量濃度在12～50 mg/mL之間時，6 種不同品種的紅樹莓葉提取物清除ABTS陽離子自由基的能力隨質量濃度增加而上升；在質量濃度大于50 mg/mL后，變化趨于平緩。在測定質量濃度范圍內，6 種紅樹莓葉提取物清除ABTS陽離子自由基能力均大于VC。在質量濃度大于50 mg/mL時所有紅樹莓葉提取物ABTS陽離子自由基清除率均高于95%。

表2 紅樹莓葉提取物清除ABTS陽離子自由基的IC50值Table 2 IC50 values for ABTS cation radical scavenging capacity of red raspberry leaf extracts

由表2可知，所有品種的紅樹莓葉提取物清除ABTS陽離子自由基的IC50值均小于VC，即紅樹莓葉提取物的ABTS陽離子自由基清除能力大于VC。6 種紅樹莓葉提取物對ABTS陽離子自由基的清除能力由大到小依次為紅寶石＞歐洲紅＞澳洲紅＞杜拉明＞哈瑞泰茲＞秋福。

2.2.2 DPPH自由基清除能力分析

如圖3所示，當樣品質量濃度在12～50 mg/mL之間時，紅樹莓葉提取物清除DPPH自由基的能力隨質量濃度增加而上升，在質量濃度大于50 mg/mL后，變化趨于平緩。在質量濃度為12～30 mg/mL時，紅寶石葉的提取物對DPPH自由基清除能力明顯高于其他品種和VC處理組。當質量濃度高于50 mg/mL時，所有品種的葉提取物清除率均穩定在85%左右，略低于VC組。

表3 紅樹莓葉提取物清除DPPH自由基的IC50值Table 3 IC50 values for DPPH radical scavenging capacity of red raspberry leaf extracts

由表3可知，秋福、哈瑞泰茲與杜拉明的DPPH自由基清除能力IC50值略高于VC，其余3 種的IC50值小于VC，其中紅寶石的IC50值為（18.16±0.11）mg/mL，明顯低于VC組。6 種紅樹莓葉提取物對DPPH自由基的清除能力由大到小依次為紅寶石＞歐洲紅＞澳洲紅＞杜拉明＞哈瑞泰茲＞秋福。

2.2.3 FRAP分析

圖4 紅樹莓葉提取物FRAPFig. 4 FRAP of red raspberry leaf extracts

表4 紅樹莓葉提取物的FRAPTable 4 FRAP values for reducing capacity of red raspberry leaf extracts

如圖4所示，紅樹莓葉提取物的FRAP與樣品質量濃度呈良好的質效關系。在質量濃度為50～70 mg/mL時，秋福、紅寶石、澳洲紅的FRAP均高于VC對照組。其余3 種略低于VC組。當質量濃度為100 mg/mL時，除杜拉明外，其他品種紅樹莓葉提取物FRAP高于VC對照組。以不同濃度FeSO4（mmol/L）溶液為橫坐標，734 nm波長處吸光度為縱坐標，得到曲線方程為y=0.560 3x＋0.157 9（R2=0.999 8），求得樣品的FRAP值見表4。由表4可知，所有品種紅樹莓葉提取物的FRAP均高于VC，6 種紅樹莓葉提取物的FRAP大小依次為秋福＞紅寶石＞澳洲紅＞歐洲紅＞哈瑞泰茲＞杜拉明。

2.3 紅樹莓葉提取物活性成分與抗氧化活性的相關性分析

表5 紅樹莓葉提取物活性成分與抗氧化活性的相關性分析Table 5 Correlation analysis between antioxidant activities and contents of active components in red raspberry leaf extracts

由表5可知，紅樹莓葉提取物的總酚與ABTS陽離子自由基清除能力（r=0.886，P＜0.05）和DPPH自由基清除能力（r=0.891，P＜0.05）有顯著的正相關關系；ABTS陽離子自由基清除能力與DPPH自由基清除能力的相關性極顯著，相關系數為0.992；即總酚對抗氧化活性的貢獻最高，在檢驗紅樹莓葉抗氧化活性時可以選用ABTS陽離子自由基清除能力與DPPH自由基清除能力中的一種與其他檢測方法共同評價紅樹莓葉片的抗氧化能力；這與Floegel等[23]的結論相似。本研究中總黃酮和原花青素與DPPH自由基清除能力和ABTS陽離子自由基清除能力均為正相關但不顯著，但總黃酮與總酚的相關性較高（r=0.801），因為黃酮從屬于多酚[24]，所以在抗氧化活性貢獻上黃酮可以歸入酚類物質行列，按照這種方法計算出總黃酮對DPPH自由基清除能力和ABTS陽離子自由基清除能力相關性為0.710和0.713，與Pearson分析結果相近（0.607、0.631）；說明在總酚的抗氧化活性貢獻上總黃酮起到了較高程度的貢獻作用，與劉世馨等[25]的實驗結果一致。

DPPH自由基清除能力和ABTS陽離子自由基清除能力與FRAP相關性不高；這與Huang Haizhi等[26]的實驗結果不同，其實驗結果表明ABTS陽離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力與FRAP均有較高的相關性。分析原因是FRAP雖然與總黃酮與原花青素的相關性較好但與總酚的相關性不高，并且葉片中總酚的含量為最高，在抗氧化貢獻上起主要作用，因此本實驗中FRAP與其余2 種方法的相關性偏低。

2.4 紅樹莓葉提取物多酚的UPLC-MS/MS鑒定

由Pearson相關性分析可知，紅樹莓葉提取物清除ABTS陽離子自由基能力和清除DPPH自由基能力與其總酚呈現顯著相關，為進一步明確紅樹莓葉提取物中的酚類物質的具體組成，利用UPLC-MS/MS法分析鑒定紅樹莓葉提取物中酚類物質，酚類物質的鑒定通過與標準品的總離子流色譜圖的母離子峰、二級質譜的碎片和保留時間等質譜行為進行比較分析。采用外標法進行酚類物質的定量分析。如圖5、表6～8所示。

圖5 樣品多酚總離子流色譜圖Fig. 5 Total ion current chromatograms of polyphenols in different samples

表6 多酚類物質質譜檢測參數Table 6 Tandem mass spectrometric parameters for polyphenols

表7 紅樹莓葉提取物中多酚含量Table 7 Polyphenol contents in red raspberry leaf extracts mg/100 g

表8 總量化多酚占總酚的百分比Table 8 Total quantified polyphenols as a percentage of total polyphenols

由表7、8可知，此方法測定出的13 種多酚總和占6 種紅樹莓葉中各自總酚的40.53%～86.07%，其中歐洲紅、哈瑞泰茲、秋福均在75%以上，而其余3 種為40.53%～49.65%。6 種紅樹莓葉中除杜拉明外蘆丁的含量最高，均超過了120 mg/100 g。丁香酸與木犀草素僅在哈瑞泰茲中鑒定出，分別為0.18 mg/100 g與0.08 mg/100 g。阿魏酸僅在杜拉明中鑒定出，為0.40 mg/100 g。檢測出的13 種量化多酚在6 種樹莓葉（根據含水量折算出干質量）中大小依次為歐洲紅478.24 mg/100 g＞哈瑞泰茲316.00 mg/100 g＞秋福272.58 mg/100 g＞紅寶石219.19 mg/100 g＞澳洲紅210.01 mg/100 g＞杜拉明209.91 mg/100 g。

本方法共檢測出6 種酚酸，其中鞣花酸為主要酚酸。Aleksandra等[27]的研究結果顯示鞣花酸也為漿果類植物的主要酚酸，此外還含有大量的阿魏酸和綠原酸；但是本實驗測定紅樹莓葉中的阿魏酸含量很低，原因可能是在果實和葉片中含量有差別，也可能是取樣時果實和葉片的成熟度不同導致。6 種紅樹莓葉除紅寶石外，對DPPH自由基與ABTS陽離子自由基清除能力強弱與其鞣花酸含量大小排列順序一致，因為紅寶石中鑒定出的酚類物質僅占其總酚的40%左右，起到顯著抗氧化作用的物質也可能是其余未檢出的酚類物質或是黃酮與原花青素類物質。

蘆丁是植物中含量最豐富的化合物之一，在漿果果實中平均占總量化多酚的44.66%，在抗氧化活性貢獻上起到重要作用[19,28-29]。本實驗中測得蘆丁含量約為總量化多酚的55%。在量化多酚占比高于70%的3 個品種（歐洲紅、哈瑞泰茲、秋福）和量化多酚占比在40%～50%間的3 個品種（澳洲紅、紅寶石、杜拉明）中蘆丁含量與清除ABTS陽離子自由基能力和清除DPPH自由基能力呈正相關。因本實驗中存在未知酚類物質的作用（未檢出），導致無法斷定蘆丁含量與抗氧化活性間的相關性是否顯著，仍需繼續深入的研究。

據報道，酚類物質在體外具有很強的抗氧化作用，存在于酚環中的雙鍵，羥基側鏈和糖基化都有助于清除自由基活性[30]。多酚類物質包括酚酸、類黃酮、芪類、單寧類等。而類黃酮物質包括黃酮醇（槲皮素、異鼠李素、金絲桃苷）、黃烷醇（兒茶素類）、黃酮（木犀草素、蘆丁）等[24]。Fukumoto等[31]認為，在多酚分子結構中B環中的羥基增強了活性，相對于3和4碳位，在3、4和5碳位均含有萜類或羥基的多酚抗氧化活性更高。Seeram等[32]研究發現在C環中連接的糖苷上糖單位數與抗氧化活性呈負相關的關系。按照此方法推斷本實驗鑒定出的類似分子結構的7 種酚類物質（除酚酸）的抗氧化活性排列順序為黃烷醇＞黃酮醇＞黃酮。但對本研究中量化多酚占總酚含量相近的樹莓品種（40%左右的3 種：澳洲紅、紅寶石、杜拉明；70%左右的3 種：歐洲紅、哈瑞泰茲、秋福）抗氧化活性強弱順序比較發現，黃烷醇含量相對較高的紅樹莓葉與其抗氧化活性并不呈良好的量效關系，無法證實此結論。但袁博等[33]的實驗中證實了黃酮醇（槲皮素）的抗氧化活性高于黃酮（蘆丁），驗證了此結論。分析其原因可能是紅樹莓中存在未知酚類物質的作用（未檢出）或多種多酚的協同作用導致的整體抗氧化活性變化。

3 結 論

本實驗比較了6 種不同品種紅樹莓葉中總酚、總黃酮、原花青素的含量及其與抗氧化活性的相關性；采用UPLC-MS/MS法對樹莓葉中多酚類物質進行定性定量檢測，該方法靈敏，高效。檢出的13 種多酚以蘆丁和鞣花酸為主，含有少量的兒茶素、表兒茶素、金絲桃苷、綠原酸、沒食子酸，微量的槲皮苷、木犀草素、異鼠李素、阿魏酸、咖啡酸、丁香酸。相較于VC，6 種紅樹莓葉提取物抗氧化活性良好。紅樹莓葉中的其他酚類（酚酸類）物質尚需進一步鑒定。