雙縮脲法測(cè)定羅非魚源膠原蛋白肽含量的改良及應(yīng)用評(píng)價(jià)

張 玲，石彩文，肖凱軍*，李春海，莫軍全，張 鐘，史煜宇

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000）

羅非魚是世界水產(chǎn)業(yè)科研和養(yǎng)殖生產(chǎn)的重點(diǎn)淡水養(yǎng)殖魚類。近十年來，我國(guó)每年羅非魚產(chǎn)量以平均4.82%左右的速度遞增，穩(wěn)居世界首位[1]，但加工產(chǎn)品主要是品種單一、水平較低、附加值不高的凍魚片和凍全魚等[2]，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的魚皮、魚鱗等副產(chǎn)物，約占魚體總質(zhì)量的40%～50%，除少部分被加工成魚粉作為飼料廉價(jià)出售，大多未得到充分利用，導(dǎo)致生物資源浪費(fèi)，也帶來一系列環(huán)境問題[3]。隨著人們對(duì)生物分子結(jié)構(gòu)及功能的認(rèn)識(shí)不斷深入以及國(guó)內(nèi)加工技術(shù)的不斷提高，利用魚皮、魚鱗提取明膠[4-6]及膠原蛋白多肽的研發(fā)[7-8]已成為熱點(diǎn)，也形成較大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)。

肽是由氨基酸組成的聚合物，主要來自于蛋白質(zhì)分解的中間產(chǎn)物。膠原蛋白肽是膠原或明膠經(jīng)酶解等處理后制得的具有較高消化吸收性、分子質(zhì)量為1 000～30 000 Da的產(chǎn)物，其不具有明膠的凝膠性能[9]，但具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，如抗氧化[10]、抗菌[11-12]、降血壓[13]、抗疲勞[14]、抗腫瘤[15]等作用，在功能性食品[16-17]、醫(yī)學(xué)[18-19]、化妝品[20-21]等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，因此測(cè)定多肽含量方法非常重要。

目前常見的多肽含量測(cè)定方法有雙縮脲法[22]、福林-酚試劑法[23]、鄰苯二甲醛法[24-25]、紫外吸收法等[26]，但同種方法測(cè)定不同類型、不同體系多肽含量的條件不同。雙縮脲比色法中最大吸收波長(zhǎng)、肽的檢測(cè)濃度范圍、pH值、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）用量對(duì)檢測(cè)方法的適用性、準(zhǔn)確度及重復(fù)性有顯著的影響且需要標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)際應(yīng)用中多選用四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）標(biāo)準(zhǔn)品[27-28]，是非羅非魚源酶解蛋白肽的同源物，測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大偏差，且價(jià)格昂貴。標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌窇?yīng)遵循同質(zhì)原則，可以消除方法基體效應(yīng)引入的系統(tǒng)誤差[26]。羅非魚皮膠原蛋白肽與羅非魚源酶解多肽的成分相近，適宜用作肽含量檢測(cè)的對(duì)照品。

本研究選擇羅非魚皮膠原蛋白肽為對(duì)照品，對(duì)雙縮脲法測(cè)定多肽的方法進(jìn)行改良，建立一套快速、相對(duì)準(zhǔn)確的羅非魚源膠原蛋白肽酶解體系肽含量檢測(cè)方法，滿足羅非魚源膠原蛋白肽生產(chǎn)及產(chǎn)品品質(zhì)相關(guān)檢測(cè)的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)稱分子質(zhì)量為1、3 kDa和5 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽，標(biāo)稱分子質(zhì)量為3 kDa和5 kDa的羅非魚鱗膠原蛋白肽（其分子質(zhì)量分布情況見文獻(xiàn)[29]）、羅非魚皮膠原蛋白（凍干品），均由廣東百維生物科技有限公司提供。

TCA、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、氫氧化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。0.1 mol/L NaOH溶液、9～13 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L HCl溶液、6 mol/L HCl溶液用于調(diào)整檢測(cè)體系pH值。

雙縮脲試劑的配制：1.5 g硫酸銅和6.0 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水中，攪拌加入300 mL的10% NaOH溶液，用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

722N可見分光光度計(jì) 上海同田生物技術(shù)有限公司；HR-120分析天平 四川中浪科技有限公司；CHYZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠；PHS-25 pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；80-2型離心機(jī) 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)流程

第1步：以羅非魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）為標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的對(duì)照品，研究肽與雙縮脲顯色絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)，尋找線性擬合良好的肽質(zhì)量濃度范圍，確定肽的理想檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍，確定線性擬合度高的pH值及TCA質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

第2步：以羅非魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）為標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的對(duì)照品，在第1步確定的理想條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并檢驗(yàn)方法的精密度和重復(fù)性。

第3步：考慮實(shí)際檢測(cè)體系中可能有水解底物以及酶等蛋白質(zhì)的影響，為明確蛋白質(zhì)的干擾影響，以羅非魚膠原蛋白為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)，加入檢測(cè)體系中，檢測(cè)本法的加樣回收率和偏差。

第4步：考慮實(shí)際生產(chǎn)中有不同分子質(zhì)量的羅非魚皮和魚鱗肽產(chǎn)品，檢測(cè)體系中肽的種類與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品（標(biāo)稱分子質(zhì)量為3 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽）有差別，為檢驗(yàn)本法在不同肽產(chǎn)品檢測(cè)中的適用性，將標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用于標(biāo)稱分子質(zhì)量為1 kDa和5 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽和標(biāo)稱分子質(zhì)量為3 kDa和5 kDa的羅非魚鱗膠原蛋白肽的檢測(cè)中，通過回收率及偏差檢驗(yàn)本法的適用性。

1.3.2 測(cè)定方法最適參數(shù)的選定

1.3.2.1 絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)的確定

分別取質(zhì)量濃度為6 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、0.2、0.5、4.0、8.0 mL于一組50 mL燒杯中，用14% TCA溶液補(bǔ)足至12 mL，立即加入8 mL雙縮脲試劑，分別調(diào)整pH 13.5（控制體積偏差不大于2.5%），立即在波長(zhǎng)470～630 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波段掃描確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.2.2 線性擬合良好的肽質(zhì)量濃度范圍的確定

分別取質(zhì)量濃度為6 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL于一組50 mL的燒杯中，用14% TCA溶液補(bǔ)足至12 mL，立即加入8 mL雙縮脲試劑，分別調(diào)整pH 12.5、13.0、13.5（控制體積偏差≤2.5%），立即于1.3.2.1節(jié)中確定的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并按照肽質(zhì)量濃度分段進(jìn)行線性回歸，以R2值大小判斷線性擬合程度，確定溶液中多肽的最佳檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍。

1.3.2.3 最適pH值的確定

以1.3.2.2節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，分別取質(zhì)量濃度為6 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、1.0、3.0、5.0 mL于一組50 mL的燒杯中，用14% TCA溶液補(bǔ)足至12 mL，立即加入8 mL雙縮脲試劑，調(diào)整pH 10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5（控制體積偏差不大于2.5%），立即于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，找出pH值變化不影響吸光度大小的區(qū)域，即為檢測(cè)最適的pH值范圍。

1.3.2.4 TCA溶液最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定

分別取7%的羅非魚皮膠原蛋白溶液（膠原蛋白需先置于50～60 ℃水浴鍋中加熱溶解）1.0 mL于20 mL的離心管中，分別立即加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、8%、10%、11%、12%、13%、14%、17% TCA溶液，靜置10 min后，3 500 r/min離心15 min。分別取上清液1.0、2.0 mL和4.0 mL于一組50 mL燒杯中，對(duì)應(yīng)加入質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液1.0、2.0 mL和2.0 mL，每個(gè)體積比一組共8 份，用對(duì)應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TCA溶液補(bǔ)足至12 mL，立即加入8 mL雙縮脲試劑，調(diào)整到最適pH值（控制體積偏差不大于2.5%），在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，找出TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不影響吸光度大小的區(qū)域，即為TCA溶液最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍。

1.3.3 最適條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以1.3.2節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，分別取質(zhì)量濃度為6 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于一組50 mL的燒杯中，用1.3.2.4節(jié)方法確定的TCA溶液最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)補(bǔ)足至12 mL，立即加入8 mL雙縮脲試劑，按1.3.2.3節(jié)方法確定的最適pH值調(diào)整（控制體積偏差不大于2.5%），立即于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以多肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制最適條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，以R2值大小判斷線性擬合程度。

1.3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

分別取質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液2 mL于一組50 mL燒杯中，按1.3.3節(jié)方法測(cè)定吸光度，再計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），檢驗(yàn)該方法的精密度。

1.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別取質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液2 mL于一組50 mL燒杯中，按1.3.3節(jié)方法測(cè)定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算多肽含量，再計(jì)算RSD，檢驗(yàn)該方法的重復(fù)性。

1.3.6 魚皮膠原蛋白肽的加樣回收率

分別取質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 mL于一組50 mL的燒杯中，按1.3.3節(jié)方法測(cè)定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算多肽含量、回收率及RSD。

1.3.7 羅非魚皮膠原蛋白肽與魚皮膠原蛋白的加樣回收率

分別取7%的羅非魚皮膠原蛋白溶液（膠原蛋白需先置于50～60 ℃水浴鍋中加熱溶解）1.0 mL于20 mL的離心管中，立即加入10 mL 1.3.2.4節(jié)確定的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TCA溶液，靜置10 min后，3 500 r/min離心15 min。分別取上清液2.0 mL于一組50 mL燒杯中，再分別加入質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液0、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 mL于燒杯中，按1.3.3節(jié)方法測(cè)定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算多肽含量、回收率及RSD。

1.3.8 羅非魚膠原蛋白肽加樣回收率

用標(biāo)稱分子質(zhì)量為1 kDa和5 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽和標(biāo)稱分子質(zhì)量為3 kDa和5 kDa的羅非魚鱗膠原蛋白肽，按照1.3.6節(jié)方法進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)。

1.3.9 羅非魚膠原蛋白肽與羅非魚皮膠原蛋白的加樣回收率

用標(biāo)稱分子質(zhì)量為1 kDa和5 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽和標(biāo)稱分子質(zhì)量為3、5 kDa的羅非魚鱗膠原蛋白肽，按照1.3.7節(jié)進(jìn)行加明膠加樣回收率實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，取平均值；采用SPSS Statistices 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用Origin 8.5軟件進(jìn)行圖片繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)的確定

圖1 雙縮脲絡(luò)合物波段掃描曲線Fig. 1 Absorption spectra of biuret complex at different concentrations

從圖1可以看出，不同質(zhì)量濃度的魚皮膠原蛋白肽在470～630 nm的最大吸收波長(zhǎng)均為545 nm，這與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的多肽與雙縮脲絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)一致，因此本實(shí)驗(yàn)確定545 nm為檢測(cè)最適波長(zhǎng)。

2.2 多肽線性質(zhì)量濃度范圍的確定

圖2 多肽線性擬合曲線Fig. 2 Linear fi tting curves of peptide

表1 多肽質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系擬合方程Table1 Linear fi tting curves between polypeptide concentration and absorbance

如圖2、表1所示，多肽質(zhì)量濃度在0.03～0.15 mg/mL與1.8～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，不同pH值的線性回歸曲線R2均低于0.99，擬合程度相對(duì)較低。而在質(zhì)量濃度為0.3～1.5 mg/mL范圍內(nèi)，不同pH值的曲線都呈線性分布，且R2大于0.99，相關(guān)性較好。因此可以確定多肽溶液最佳檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍為0.3～1.5 mg/mL。

2.3 最適pH值的確定

圖3 最適pH值曲線Fig. 3 Determination of optimal pH

由圖3可知，在pH 10.5～12.0范圍內(nèi)魚皮膠原蛋白多肽溶液的吸光度隨著pH值的增大而不斷增大，而在pH 12.5～13.5內(nèi)呈現(xiàn)出吸光度大小不受pH值變化的影響，即pH 12.5～13.5為檢測(cè)最適pH值范圍，在此范圍內(nèi)多肽含量的檢測(cè)不受pH值影響，因而從經(jīng)濟(jì)效益及操作安全方面考慮，選擇最適pH值為12.5。

2.4 最適TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

圖4 最適TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)曲線Fig. 4 Determination of optimum TCA concentration

由圖4可知，在TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～10%范圍內(nèi)吸光度很大且曲線平緩，是因?yàn)槭褂玫腡CA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)不足以沉淀膠原蛋白，TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)微弱的變化就能很明顯地展現(xiàn)在曲線上，因此在TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～10%的曲線相對(duì)陡峭；TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～12%范圍內(nèi)曲線下降趨勢(shì)逐漸趨于平緩；而TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在14%～17%時(shí)吸光度也有較明顯的下降，這可能是因?yàn)門CA過量造成體系pH值過低，促使部分多肽水解成氨基酸。3 條曲線在TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)13%～14%的范圍內(nèi)吸光度大小均表現(xiàn)出不受TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的影響。研究TCA用量對(duì)不同比例膠原蛋白和肽體系中檢測(cè)吸光度的影響，目的是找出TCA用量不影響肽含量檢測(cè)的范圍，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%～14%滿足要求，再結(jié)合成本考慮，可選擇最適TCA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%。

2.5 最適條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇標(biāo)稱分子質(zhì)量為3 kDa的羅非魚皮膠原蛋白肽為對(duì)照品，在質(zhì)量濃度0.3～1.5 mg/mL范圍內(nèi)，用蒸餾水配制質(zhì)量濃度為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mg/mL的肽溶液，添加13% TCA溶液，調(diào)整體系pH 12.5（控制體積偏差不大于2.5%），在波長(zhǎng)545 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

擬合方程為y=0.144 9x＋0.001 5，R2為0.999，表明該方法中吸光度與樣品質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，可應(yīng)用于雙縮脲法測(cè)定多肽含量，線性質(zhì)量濃度范圍為0.3～1.5 mg/mL。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision for fi sh skin collagen peptide (3 kDa)

取質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液2 mL共6 份，按照最佳條件加入檢測(cè)試劑（最終肽溶液被稀釋成20 mL，質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL），并測(cè)定吸光度。由表2可知，RSD為1.84%，說明本測(cè)定方法的精密度較好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability for fi sh skin collagen peptide (3 kDa)

取質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液2 mL共6 份，按照最佳條件加入檢測(cè)試劑，并測(cè)定吸光度，再根據(jù)線性回歸方程計(jì)算多肽的含量，再計(jì)算RSD，檢驗(yàn)該方法的重復(fù)性。由表3可知，測(cè)定含量平均值為107.7%，RSD為1.86%，說明本測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.8 魚皮膠原蛋白肽的加樣回收率

表4 魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）加樣回收率Table 4 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (3 kDa)

用質(zhì)量濃度為9 mg/mL的3 kDa羅非魚皮膠原蛋白肽溶液，在最佳檢測(cè)條件下配制成不同質(zhì)量濃度的檢測(cè)體系，檢測(cè)吸光度，計(jì)算肽的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，并計(jì)算平均回收率。由表4可知，平均回收率為109.7%，RSD為1.00%。

2.9 魚皮膠原蛋白肽與膠原蛋白的加樣回收率

表5 魚皮膠原蛋白肽（3 kDa）與魚皮膠原蛋白的加樣回收率Table 5 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (3 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

在檢測(cè)體系中引入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的羅非魚皮膠原蛋白溶液，在固定條件下肽的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度，與樣品真實(shí)質(zhì)量濃度進(jìn)行比較并計(jì)算加樣回收率。由表5可知，平均回收率為113.9%，RSD為1.39%。與2.8節(jié)的回收率和RSD結(jié)果接近，說明此工藝條件測(cè)定多肽含量不會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白水解，此法測(cè)定多肽含量的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2.10 羅非魚膠原蛋白肽及魚皮膠原蛋白的加樣回收率

表6 魚皮膠原蛋白肽（5 kDa）加樣回收率Table 6 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (5 kDa)

表7 魚皮膠原蛋白肽（5 kDa）與魚皮膠原蛋白的加樣回收率Table 7 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (5 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

表8 魚皮膠原蛋白肽（1 kDa）加樣回收率Table 8 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (1 kDa)

表9 魚皮膠原蛋白肽（1 kDa）與魚皮膠原蛋白的加樣回收率Table 9 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (1 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

表10 魚鱗膠原蛋白肽（5 kDa）加樣回收率Table 10 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (5 kDa)

表11 魚鱗膠原蛋白肽（5 kDa）與魚皮膠原蛋白的加樣回收率Table 11 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (5 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

表12 魚鱗膠原蛋白肽（3 kDa）加樣回收率Table 12 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (3 kDa)

表13 魚鱗膠原蛋白肽（3 kDa）與魚皮膠原蛋白的加樣回收率Table 13 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (3 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

從表6～13可以看出，改變檢測(cè)體系中的羅非魚肽的種類后，加樣回收率相差不大，偏差均較小，說明本法適用于羅非魚源肽含量的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，雙縮脲比色法檢測(cè)魚皮膠原蛋白肽的最佳工藝條件為波長(zhǎng)545 nm、體系pH 12.5、1 3% T C A溶液，肽測(cè)定的線性質(zhì)量濃度范圍為0.3～1.5 mg/mL，得到重復(fù)性和精密度實(shí)驗(yàn)的RSD分別為1.86%、1.84%，加入膠原蛋白與未加入膠原蛋白的平均回收率分別為113.9%、109.7%，RSD分別為1.39%、1.00%，相差不大；將本法應(yīng)用于不同種類羅非魚肽產(chǎn)品體系的檢測(cè)，加樣回收率相差不大，偏差都較小，說明本法適用于羅非魚源肽含量的檢測(cè)。

雙縮脲法既能測(cè)定蛋白質(zhì)含量也能測(cè)定肽含量，其機(jī)理主要是雙縮脲試劑與蛋白質(zhì)和肽結(jié)構(gòu)中—CONH—基團(tuán)在堿性環(huán)境中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)生成顯色絡(luò)合物。本法采用TCA去除體系中存在的酶解底物及酶等蛋白質(zhì)對(duì)肽含量檢測(cè)的干擾，但加入TCA可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的水解，造成檢測(cè)結(jié)果偏高。本研究發(fā)現(xiàn)體系pH值對(duì)絡(luò)合物顯色情況有重要影響，當(dāng)pH值在3.5～4.5之間時(shí)，體系由無色轉(zhuǎn)變成淺藍(lán)色；在pH 8～9之間才會(huì)由淺藍(lán)色變成紫色；在pH 10.0～12.5之間，pH值越高，體系吸光度越大，pH值會(huì)影響測(cè)定結(jié)果；在pH 12.5～13.5之間，pH值不再影響吸光度的測(cè)定。調(diào)整體系pH值一定要精確、迅速并控制調(diào)整后的總體積偏差。體系中多肽含量范圍對(duì)線性關(guān)系也很重要，為提高檢測(cè)準(zhǔn)確度，一定要控制體系多肽質(zhì)量濃度在0.3～1.5 mg/mL范圍內(nèi)。此外，樣品檢測(cè)體系調(diào)整好后應(yīng)立即測(cè)定吸光度，必須在1 min內(nèi)完成檢測(cè)，否則體系會(huì)產(chǎn)生肉眼能見的色差，造成檢測(cè)誤差。

本研究遵循同質(zhì)原則，選用羅非魚皮膠原蛋白肽作為對(duì)照品，對(duì)經(jīng)典的雙縮脲法測(cè)定多肽含量中幾個(gè)關(guān)鍵影響因素進(jìn)行了細(xì)化研究，找到了理想條件，建立了一套較為精確的檢測(cè)方法，適應(yīng)于羅非魚源膠原蛋白肽含量的快速檢測(cè)，具有良好的實(shí)際應(yīng)用前景；但對(duì)于其他魚類膠原蛋白肽含量的檢測(cè)是否適用，則需進(jìn)一步研究。