頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析大鯢不同部位揮發(fā)性成分

辛 茜，陳德經(jīng)*，陳小華，賈少杰

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學(xué) 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001）

中國大鯢（Andrias davidianus）俗稱娃娃魚，屬脊索動物門、脊椎動物亞門、兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科、雌雄異體、卵生。大鯢起源于3.5億年前的泥盆紀時期，素有“活化石”之稱[1]。大鯢機體中含有50多種天然生物活性物質(zhì)，在食用[2]、藥用[3]、保健產(chǎn)品[4]的開發(fā)利用方面具有獨特作用和較高的經(jīng)濟價值。大鯢的營養(yǎng)豐富，但不論野生或是人工養(yǎng)殖，均有不同程度的腥臭味。區(qū)別在于人工養(yǎng)殖投喂凍魚餌料，會比野生大鯢的腥味重，大鯢的腥味嚴重限制了大鯢深加工產(chǎn)品的開發(fā)利用。

迄今為止，已知的腥味成分有胺類、揮發(fā)性含硫化合物、揮發(fā)性低級脂肪酸、揮發(fā)性羰基化合物等[5]。周若琳等[6]研究發(fā)現(xiàn)草魚不同部位揮發(fā)性腥味成分以醇類、醛類為主；劉奇等[7]通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatgraphymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）從鱘魚腹肉、背肉、尾肉、皮、鰓和肝中共檢出60多種揮發(fā)性物質(zhì)，其中己醛、1-辛烯-3-醇等是構(gòu)成鱘魚魚腥味的主要成分，有青草味、魚腥味及脂類氣味；李龍飛等[8]對香港牡蠣肉中的腥味物質(zhì)進行探究，檸檬烯、己醛、庚醛、辛醛、2-辛烯醛、苯甲醛、2-壬烯醛、1-戊烯-3-醇、1-辛烯-3-醇、(Z)-1,5-辛二烯-3-醇、2,4-癸二烯醛和2-辛烯-1-醇是牡蠣肉的主要腥味成分。目前，國內(nèi)外鮮見對大鯢腥味揮發(fā)性成分的研究。本實驗采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)，對大鯢不同部位揮發(fā)性物質(zhì)進行研究，確定大鯢主要腥味揮發(fā)性成分及特征氣味，為大鯢的腥味研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機選取3 條大鯢，體質(zhì)量2 kg，健康無病害的子二代個體，由陜西省資源生物重點實驗室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N-5973N型GC-MS儀 美國Agilent公司；手動SPME進樣手柄、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭 美國Supelco公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

將3 條鮮活的大鯢用220 V的電壓電擊至?xí)?，時間90 s，再用溫度80～85 ℃的熱水熱燙，時間60 s，刮去黏液，用刀在大鯢頜下開口放血，去頭和內(nèi)臟，清洗干凈后，剝皮、取肉和爪子。分別從3 條大鯢身上各取肉、爪、皮10 g分裝入頂空瓶中，置于-4 ℃冷藏冰箱備用，在4 h之內(nèi)進行實驗。

1.3.2 SPME

65 μm的PDMS/DVB萃取頭第1次使用時，在GC進樣口250 ℃老化12 h，以后每次在使用前活化30 min。將準備好的大鯢肉（爪、皮）在水浴溫度50 ℃，超聲條件下平衡30 min，萃取頭插入頂空瓶中，調(diào)節(jié)萃取頭的高度，萃取頭距頂端4 mm左右，50 ℃水浴超聲吸附30 min后取出萃取頭，迅速將其插入GC進樣口中，250 ℃解吸5 min后，取出萃取頭，用于GC-MS分析檢測。每個樣品處理3 次分別進單針得到結(jié)果。

1.3.3 GC-MS分析條件

GC條件：DB-5MS彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流模式進樣；升溫程序：柱初溫40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至100 ℃，而后以5 ℃/min升至290 ℃，保持15 min；進樣口溫度250 ℃；載氣（He）流量1.0 mL/min。

MS條件：傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z33～650。

1.3.4 揮發(fā)性成分評價

參考Welke等[9]的方法，采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法，確定對大鯢肉、爪、皮貢獻最大的組分。ROAV越大，則該組分對樣品總體風(fēng)味貢獻越大。ROAV按下式計算：

式中：CA、TA分別為物質(zhì)A的相對含量/%和感覺閾值/（μg/kg）；Cstan、Tstan為對樣品總體風(fēng)味貢獻最大的組分的相對含量（以壬醛為標準物質(zhì)）/%和感覺閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將萃取出的揮發(fā)性成分通過系統(tǒng)自帶NIST 05質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行定性確認，取匹配度80%以上者；通過面積歸一化法求得各成分在不同樣品揮發(fā)性成分中的相對含量；并對實驗結(jié)果進行方差分析，數(shù)據(jù)由SPSS 21.0進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢不同部位揮發(fā)性成分分析

分別對大鯢的肉、爪和皮3 個部位進行GS-MS分析，得到大鯢3 個部位的總離子流圖，經(jīng)NIST 05質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索分別檢出57、69、49 種揮發(fā)性成分，如表1所示。

表1 大鯢肉、爪和皮的揮發(fā)性成分分析Table 1 Volatile components of meat, claws and skin of giant salamander

續(xù)表1

續(xù)表1

如表1所示，從大鯢肉、爪、皮中共鑒定出114 種揮發(fā)性成分，其中包括醛類11 種、酮類8 種、醇類5 種、酸類18 種、烴類42 種、酯類15 種等，3 個部位共有的揮發(fā)性成分15 種。由表1可知，在大鯢體中共檢出11 種醛類化合物，主要是辛醛、壬醛、癸醛、己醛等飽和直鏈醛，主要來源于不飽和脂肪酸的分解，不飽和醛所占比例很少[10]，大鯢肉、爪和皮分別有醛類9 （3.87%）、4 種（7.32%）和5 種（53.06%）?？荡浯涞萚11]研究發(fā)現(xiàn)飽和直鏈醛在美國紅魚魚肉中的相對含量較高，尤其是己醛，閾值只有4.5 μg/kg，本實驗中僅在大鯢皮中未檢出。大鯢肉、爪、皮都鑒定出了壬醛和辛醛，是油酸的氧化產(chǎn)物，閾值低，有魚腥味、油脂味和青草味[12]，作為水產(chǎn)腥味的重要來源之一，對大鯢的腥味貢獻很大，其中大鯢皮中的壬醛和辛醛相對含量明顯高于大鯢肉和爪，采集樣品時，能明顯察覺到大鯢皮中強烈的魚腥味、油脂味等，而大鯢肉中的氣味則較柔和，可能跟苯甲醛作為烤花生的主要風(fēng)味成分，有令人愉快的氣味有關(guān)[13]。在大鯢皮中鑒定出的2-壬烯醛具有脂肪味、蘑菇味和蠟香[14]，低閾值，也對大鯢腥味有一定的影響。

酮類化合物相比于醛類，種類相對較少，在大鯢肉、爪、皮中僅鑒定出2、4 種和3 種，其相對含量分別為1.36%、2.48%、6.19%。酮類化合物閾值高，對大鯢腥味特征貢獻較小，大多是不飽和脂肪酸、微生物氧化產(chǎn)生的或者是氨基酸的降解產(chǎn)物[15]。

醇類化合物共檢出1-辛烯-3-醇、2-乙基-1-己醇、1-辛醇等5 種，其中在大鯢肉、爪、皮中相對含量分別為1.12%、2.25%、7.81%。一般認為，醇類感覺閾值較高，對氣味貢獻不是很大[16]。但不飽和醇如1-辛烯-3-醇與壬醛閾值（1 μg/kg）相當(dāng)，且具有蘑菇味和油膩味，對大鯢的腥味貢獻很大，有研究認為其可以作為魚肉新鮮度的衡量指標[17]。此外，1-辛醇形成令人不愉快的土腥味、金屬味[18]。

烴類化合物在很多水產(chǎn)中都有報道，在大鯢中鑒定出的種類豐富，但每種化合物相對含量較低，大鯢肉、爪、皮中分別有20、34 種和20 種，相對含量分別為11.59%、23.73%、7.56%，但是烴類化合物普遍閾值高，對大鯢腥味的直接貢獻不大。烯烴類在一定條件下會形成醛、酮，所以會對大鯢腥味存在潛在影響[19]。酯類化合物在大鯢中鑒定出的種類較少，但在皮中相對含量（20.41%）明顯高于肉（0.80%）和爪（9.51%），酯類因為閾值高對大鯢總體腥味影響不大[20]。

酸類檢出較多，相對于大鯢皮（0.33%），在大鯢肉和大鯢爪中的相對含量非常高（30.01%、48.95%），可能與脂肪含量有關(guān)。這類化合物在水產(chǎn)揮發(fā)性成分的研究中報道較少。小分子的飽和直鏈酸有刺激性氣味，如戊酸有特殊的臭味，癸酸有不愉快的氣味，苯甲酸具有苯或甲醛的臭氣味[21]。胺類化合物普遍具有臭味，對大鯢的腥味特征貢獻很大[22]；還鑒定出了苯酚類、嗎啡啉類等化合物，大部分含量較高，對大鯢的腥味影響不大。

徐偉良等[23]利用靜態(tài)頂空-GC-MS聯(lián)用分析了大鯢皮膚分泌物中的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)大鯢分泌物中臭味成分為二甲基二硫醚，在大鯢的肉、爪、皮3 個部位中并未發(fā)現(xiàn)該刺激性成分。章超樺等[24]研究發(fā)現(xiàn)新鮮鯽具有以草腥味、泥土味等混合的氣味，其強度以內(nèi)臟最強，皮次之，肌肉最弱，從感官上判斷大鯢爪子和皮的腥味也超過了肌肉；鑒定出的同鯽特征氣味最為相關(guān)的成分為己醛，還有1-戊烯-3-酮、2,3-戊二酮、1-戊烯-3-醇、反-2,順-4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、1,5-辛二烯-3-醇等。在大鯢肉、爪、皮中同樣鑒定出的己醛和1-辛烯-3-醇為大鯢提供了草腥味、泥土味和蘑菇味，其他成分未鑒定出[25]。王國超等[26]在研究羅非魚時證實土臭素和2-甲基異莰醇是羅非魚肉土腥味的主要來源，然而在大鯢中是1-辛烯-3-醇和1-辛醇為大鯢爪和皮的土腥味做出了貢獻。吳容[27]在分析暗紋東方鲀?nèi)鈸]發(fā)性成分時鑒定出了三甲胺，三甲胺是魚腥味特有的揮發(fā)性成分，而在大鯢中并未檢測出。

2.2 大鯢各部位關(guān)鍵揮發(fā)性成分

通常將人能感受到的某種物質(zhì)的最低濃度定義為感覺閾值。濃度一定時，感覺閾值越低越容易被感知，感覺閾值一定時，濃度越高越易被感知[28]。因此，可采用ROAV將二者結(jié)合起來對物質(zhì)氣味進行評價[29]。樣品中對總體風(fēng)味貢獻最大組分的ROAV定義為100，ROAV越大，則該組分對大鯢總體腥味貢獻越大，ROAV不小于1的組分均為分析樣品的關(guān)鍵腥味化合物。

如表2所示，低分子碳鏈的醛、不飽和醇類等對大鯢整體風(fēng)味有較大貢獻，這些物質(zhì)大都具有較低的感覺閾值，在較低的濃度下能被人感知，并且具有一定的風(fēng)味活性，分別呈現(xiàn)出青草味、果香味、蘑菇味、油膩味、哈喇味、魚腥味、泥土味等不同的風(fēng)味特征。

在大鯢肉中ROAV大于1的腥味揮發(fā)性成分由高到低依次為壬醛、癸醛、辛醛、己醛、十一醛；大鯢爪中則為壬醛、己醛、辛醛、1-辛烯-3-醇、庚醛；大鯢皮中為壬醛、辛醛、2-壬烯醛、癸醛；這些揮發(fā)性成分對大鯢肉、爪、皮的整體風(fēng)味影響很大。其中，0.01≤ROAV＜1，揮發(fā)性成分為苯甲醛、苯乙烯、2-十一酮、1-辛醇、丙酸丁酯、丁酸丁酯、異丁酸丁酯，對大鯢的整體風(fēng)味有重要修飾作用。而2-乙基-1-己醇、己酸丁酯、戊酸、癸酸、十一烷、十二烷、十四烷的ROAV均低于0.01，對大鯢的風(fēng)味仍有輔助作用。因此，結(jié)合GC-MS的分析結(jié)果和各部位所鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)的ROAV，壬醛、辛醛、庚醛、己醛、癸醛、十一醛、1-辛烯-3-醇是共同構(gòu)成大鯢腥味的關(guān)鍵腥味揮發(fā)性成分。

表2 大鯢肉、爪、皮揮發(fā)性化合物的ROAV及其氣味特征Table 2 ROAV and odor characteristics of volatile compounds in meat, claw and skin of giant salamander

3 結(jié) 論

采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用法對大鯢不同部位中的揮發(fā)性成分進行分析鑒定。從大鯢不同部位中共鑒定出114 種揮發(fā)性成分，肉、爪、皮分別鑒定出57、69 種和49 種，其中共有15 種揮發(fā)性成分，包括醛、酮、醇、烴和酸類等，醛類化合物對大鯢的腥味貢獻最大，其中壬醛、庚醛魚腥味，1-辛烯-3-醇、1-辛醇呈土腥味。